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Thèse soutenue

L'échangeur de Na+/H+ NHE1, structure du gène, régulation hormonale, et identification du site de liaison de l'amiloride

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Auteur / Autrice : Laurent Counillon
Direction : Jacques Pouysségur
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie
Date : Soutenance en 1993
Etablissement(s) : Nice
Jury : Président / Présidente : Michel Lazdunski
Examinateurs / Examinatrices : Nicolas Glaichenhaus
Rapporteur / Rapporteuse : R. Reithmeier, B. Rossier

Résumé

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L'échangeur Na+/H+ NHE1 est une protéine transmembranaire, ubiquitairement exprimée dans les cellules eucaryotes. Ce transporteur, activé par les facteurs de croissance et bloqué par un diurétique antihypertenseur, l'amiloride, joue un rôle crucial dans la régulation du pH et du volume cellulaires. D'autres isoformes (NHE2, NHE3), exprimées sur la face apicale de cellules épithéliales de rein et d'intestin possèdent une sensibilité plus faible pour l'amiloride et sont spécialisées dans les transports transépithéliaux. L'identification d'acides aminés impliques dans l'interaction des échangeurs Na+/H+ avec l'amiloride a été rendue possible par l'approche génétique suivante : 1) clonage de l'ADNc codant pour l'isoforme NHE1 des fibroblastes AR300 sélectionnés pour leur résistance à l'amiloride. Ces cellules surexpriment un échangeur muté ayant une affinité réduite pour cet inhibiteur ; 2) identification d'une mutation ponctuelle (L167F) dans le quatrième domaine transmembranaire de l'échangeur par comparaison de séquence entre l'ADNc codant pour l'échangeur muté et l'ADNc sauvage. Cette seule mutation est responsable de la diminution d'affinité pour l'amiloride ; 3) des expériences de mutagenèse dirigée ont permis de localiser un autre résidu de l'échangeur (F165) intervenant dans le transport du sodium et dans l'interaction avec l'amiloride ; 4) il a été démontré que l'acquisition du phénotype de résistance des cellules AR300 s'est faite par l'apparition de la mutation L167F sur un des deux allèles de l'échangeur, puis par amplification génique de l'allèle muté. Cet ADNc muté conférant une résistance à l'amiloride a été utilisé comme marqueur pour la construction d'un vecteur universel de sélection pour cellules eucaryotes. Un nouvel inhibiteur aux propriétés anti-ischémiques a été testé sur les isoformes NHE1, NHE2 et NHE3. Il s'est révélé beaucoup plus discriminatif que l'amiloride et ses dérivés 5-N substitués. Le gène de l'échangeur NA#+/H#+ NHE1 a été cloné. Son organisation en introns et exons a été déterminée. L'identification de son promoteur a permis la mise en évidence de sites consensus de liaison pour certains facteurs de transcription