Alginate lyase d'une bactérie marine ATCC 433367 : purification, clonage, séquence du gène et expression chez Escherichia coli

Alginate lyase of the marine bacterium atcc 433367: purification, cloning, gene sequencing and expression in escherichia coli

• Auteur / Autrice : Martine Malissard
• Direction : Micheline Guinand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences. Biochimie
• Date : Soutenance en 1993
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Micheline Guinand

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bacillus circulans

Escherichia coli

Expression génique

Séquence nucléotidique

Pseudomonas aeruginosa

Alginates

Résumé

L'alginate, facteur de virulence de p. Aeruginosa, protege la bacterie de la phagocytose et empeche la penetration des antibiotiques. Le but de notre travail etait de selectionner et d'obtenir en grande quantite une alginate lyase montrant une bonne specificite pour l'alginate de p. Aeruginosa. Une premiere enzyme produite par b. Circulans atcc 15518 a ete purifiee. Le rendement est faible et l'analyse de la fraction purifiee met en evidence un complexe indissociable enzyme-polysaccharide. La souche d'e. Coli tc4/pal a3, contient le plasmide pal a3 dans lequel le gene alxm codant pour l'alginate lyase de la bacterie marine atcc 433367 a ete clone, elle est productrice d'alginate lyase. L'enzyme est periplasmique, sa purification a necessite deux etapes. Le rendement est de 17% (0,05 mg/l de culture) et l'activite specifique sur un alginate commercial non acetyle est de 40 unites/mg, elle est deux fois plus importante sur un alginate de p. Aeruginosa acetyle a 46%. Sa masse est de 30 kda par electrophorese en conditions non reductrices. On observe deux fragments de 20 et 10 kda en conditions reductrices, ce qui demontre une proteolyse de la proteine a l'interieur d'un pont disulfure. Le gene alxm a ete sequence, amplifie par pcr, et le fragment resultant a ete clone dans le pet 12a. Le plasmide recombinant a servi a transformer des souches lysogeniques d'e. Coli. La purification de l'enzyme surexprimee comporte une seule etape, le rendement est de 67% (56 mg/l de culture). Des etudes de prediction de structure secondaire et des recherches d'homologie avec trois autres alginate lyases ont ete effectuees