Thèse soutenue

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Auteur / Autrice : Christophe Gilbert
Direction : Raymond Portalier
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences. Génétique et microbiologie
Date : Soutenance en 1993
Etablissement(s) : Lyon 1
Jury : Président / Présidente : Raymond Portalier

Mots clés

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Résumé

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Les bacteries lactiques, gram positives, possedent un systeme proteolytique complexe et essentiel (proteinases et exopeptidases) assurant la degradation des caseines du lait. Quatre aminopeptidases (api-iv), une x-prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase (x-pro-dpap) et une proteinase de paroi etaient identifiees chez la souche lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus cnrz397. Nos travaux ont consiste a purifier a partir d'extraits de paroi cette cysteine-proteinase hydrolysant rapidement les caseines. Le monomere de poids moleculaire 170000 est actif dans les conditions optimales suivantes: temperature, 42c et ph 5,5. Un mutant deficient pour cette activite a ete obtenu. Par ailleurs, une proline iminopeptidase (pro-ip) a ete mise en evidence dans la paroi du lactobacille. Le gene pip codant pour cette pro-ip a ete clone puis sequence (981 paires de bases dont les 20 premiers acides amines codes du cote nh2-terminal forment une region hydrophobe semblable aux sequences signals des proteines exportees chez les lactocoques). L'expression du gene pip chez e. Coli permet d'obtenir une activite pro-ip amplifiee 1000 fois, dont 50% sont retrouves dans le periplasme, ce qui a facilite la purification de l'enzyme. Cette serine-protease active sous la forme d'un trimere de poids moleculaire 105000 (3 sous-unites de 35000), agit exclusivement sur les di- et tripeptides dans lesquels la proline est en position amino-terminale. L'enzyme est stabilisee en presence de serumalbumine de buf a 30c et a un ph compris entre 6,0 et 7,0. Les 11 premiers acides amines de la sequence nh2-terminale de la pro-ip purifiee correspondent exactement aux residus 33 a 43 traduits du gene pip. La presence d'une autre enzyme, de type aminopeptidase p, liberant un acide amine lie au cote imine d'une proline, a ete mise en evidence. Enfin, le clonage de la x-pro-dpap du lactobacille chez lactococcus lactis s'etant heurte a des problemes de recombinaison et de rearrangement d'adn, de nouvelles souches hotes de lactococcus lactis ont ete isolees