Analyse différentielle de protéases à large spécificité : mise au point d'une méthodologie d'étude sur le modèle sérum albumine bovine/subtilisines

Differential analysis of large specificity proteases. Elaboration of a methodology using the model bovine serum albumin: subtilisins

• Auteur / Autrice : Sylvie Demay
• Direction : Bernard Verneuil
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 1993
• Etablissement(s) : Limoges
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Limoges. Faculté des sciences et techniques

Mots clés

Mots clés contrôlés

Subtilisine

Bovins

Sérum-albumine

Cinétique enzymatique

Résumé

La strategie de proteolyse d'un substrat macromoleculaire par une protease est definie comme l'ensemble des voies paralleles et successives de degradation de ce substrat. Elle depend non seulement des specificites primaire et secondaire de l'enzyme vis-a-vis du substrat, mais aussi de l'accessibilite au substrat. L'etape initiale de proteolyse de la serum albumine bovine par les subtilisines carlsberg, bpn et proteinase k conduit a la liberation des memes peptides. Leur caracterisation, basee sur une approche methodologique qui associe des techniques separatives telles que la chromatographie d'exclusion, la clhp en phase inversee et l'electrophorese sur gel de polyacrylamide, a permis d'identifier les premiers sites de coupure de la serum albumine bovine par chacune de ces trois proteases. L'etude de l'effet de l'environnement des sites de coupure sur l'efficacite de catalyse (kcat/km), realisee sur substrats synthetiques, a montre que chacune des trois proteases necessitait une sequence minimale p3-p2-p1-p1-p2 autour du site clive pour exprimer sa specificite. L'efficacite catalytique est tres fortement accrue lorsque le peptide est de forme hexapeptidique avec la presence d'un site p4. Par ailleurs, cette etude a conduit a la mise en evidence de differences significatives de specificite entre les subtilisines. L'etude des produits intermediaires liberes par un degre d'hydrolyse (dh) donne, ainsi que le suivi de la liberation des dipeptides (produits terminaux) en fonction du dh ont permis d'associer le comportement des subtilisines carlsberg et bpn au modele one by one de linderstrom-lang et la proteinase k au modele zipper. De plus, les subtilisines carlsberg et bpn, bien qu'appartenant au meme modele, ont pu etre differenciees sur la base de leur rendement de production de dipeptides. La methodologie d'etude comparee des strategies de proteolyse de differentes proteases peu specifiques, presentee dans ce travail, peut etre appliquee a la differenciation des etats structuraux matures d'une proteine produite par genie genetique et de son homologue naturel