Approches méthodologiques de la quantification relative des ARNm réticulocytaires par amplification compétitive

• Auteur / Autrice : Binqiu Liu
• Direction : Claudine Soria
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie
• Date : Soutenance en 1992
• Etablissement(s) : Rouen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Amplification génique

PCR (génétique)

ARN messagers

Résumé

Depuis de nombreuses années l'exposition des gènes de globines est principalement étudiée par la mesure des rapports de synthèse des différentes chaînes de globines, c'est à dire l'analyse du stade final de l'expression de ces gènes, dans les cellules n'ayant plus qu'une activité vestigiale de synthèse protéïque. Peu d'études ont porté sur la quantification des ARNm de globines mais elles ont montré que la présence d'ARNM n'était pas toujours corélée à la présence de la protéïne. Ceci peut d'expliquer, en outre par une altération de l'efficactité de la traduction des ARNm. Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur la mise au point d'une approche méthodologique de quantification des ARNm de globines par amplification compétitive. Elle a été réalisée en quatre étapes : 1) préparation en grande quantité de plasmides contenant les gènes de globines alpha, bêta et gamma humaines, 2) optimisation des conditions d'amplification de ces gènes (concentration en MgC12, nombre de cycles d'amplification, chois des amorces et température d'hybridation) avec des amorces situées de part et d'autre du premier intron de chacun de ces gènes, 3) synthèse des ADN complémentaires (ADNc) à partir d'amorces spécifiques ou d'un oligoDt et d'ARN totaux extraits de réticulocytes obtenus à partir de sang périphérique, 4) mise au point de la quantification de ces ARNc (c'est à dire ARNm) par une technique originale et très sensible : l'amplification compétitive. L'originalité de cette approche méthodologique réside dans le fait que l'ADNc de concentration inconnue est co-amplifié avec un contrôle interne (le gène correspndant) de concentration connue, et grâce à un meêm couple d'amorces. Par cette approche, nous avons obtenuun rapport ARNm alpha / ARNm bêta = 4 chez un individu normal. Cette procédure peut être étalonnée biologiquement et appliquée à divers projets d'étude de la régulation de a transcription des gènes de globines tels l'expression des gènes au cours de l'ontogénèse, l'induction de la synthèse de l'HbF par divers médicaments ou par certains facteurs de croissance et enfin l'expression des gènes dans les thalassémies héréditaires.