Adenylate cyclase de rhizobium meliloti : analyse du site actif et definition d'un motif commun aux proteines fixant les nucleotides

Rhizobium meliloti adenylate cyclase: active site analysis and definition of a common motif for nucleotide-binding proteins

• Auteur / Autrice : ANNIE BEUVE
• Direction : Antoine Danchin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1992
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

L'adenylate cyclase (ac) est un enzyme responsable de la synthese d'ampc. Ce messager etant largement distribue, le postulat d'utiliser les acs comme temoins de l'evolution a ete pose. La caracterisation de l'ac de r. Meliloti a ainsi ete realisee. Une fusion avec le gene lacz d'e. Coli a permis la purification de l'hybride ac-bgalactosidase. Les caracteristiques biochimiques de cet enzyme ont ete determinees. Cette ac a des identites avec les acs et gcs eucaryotes. Cette identite de sequence avec des gcs et une forte inhibition de son activite par le gtp amena a l'etude du site actif par modification de sa specificite de substrat. Nous avons recherche par mutagenese au hasard de cette ac, des mutants exprimant une activite gc apres avoir construit un crible phenotypique detectant cette activite chez e. Coli. Cela a permis de determiner une partie du site actif des cyclases. Cette region ainsi definie comme nouveau site de fixation des nucleotides triphosphates (ntp) a ete retrouvee chez d'autres proteines fixant l'atp: les atpases a intermediaire phosphoryle. Un deuxieme consensus commun a ete mis en evidence. Ces deux enzymes qui catalysent des reactions differentes ont la meme poche de fixation des ntp. La structure transmembranaire des atpases est similaire a celle des acs eucaryotes et typique de toute une famille de transporteurs. Cela nous permet de proposer que ces enzymes derivent d'un transporteur fixant l'atp. Une dissection plus fine de ce site actif a ete entreprise par mutagenese dirigee. Elle met en evidence l'implication, dans le site actif, de 3 des 4 regions communes aux acs et gcs