Caractérisation et utilisation de gènes du métabolisme bactérien pour la détection spécifique d'Escherichia Coli, shigella spp. Et de Streptococcus pyogènes par sondes nucléiques

= Characterization and use of bacterial metabolic genes for specific detection of Escherichia coli - Shiella spp. And streptococcus pyrogene by nucleic acid probes

• Auteur / Autrice : Philippe Cleuziat
• Direction : Janine Robert-Baudouy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique moléculaire
• Date : Soutenance en 1992
• Etablissement(s) : Lyon, INSA
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LGMM – Génétique Moléculaire des Microorganismes, UMR 24 CNR (Lyon, INSA1982-1994)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glucuronidase

Réaction de polymérisation en chaîne

Techniques de sonde moléculaire

Résumé

L'identification de micro organismes d'importance médicale ou sanitaire par hybridation moléculaire est apparue dans les années 80 et connaît actuellement un développement rapide, notamment dans le domaine de la bactériologie. La conception de sondes nucléiques pour la détection d'espèces bactériennes a été abordée rationnellement sur la base de caractères biochimiques qui leur sont1 propres :la β-glucuronidase (β-GUR) d'Escherichia coli et la pyrrolidone carboxylyl peptidase (PYRase) de Streptococcus pyogenes. La région uid du chromosome d' E. Coli, comprenant le gène de sturcutre de la β-GUR (uidA) et son principal gène régulateur (uidR) s'avère un marqueur génétique caractériqtique des espèces E. Coli et Shigella spp. (S, boydii, S Dysenteriae, S, flexneri et S ; sonnei). L'hybridation de sondes ayant pour cible ce locus génimique unicode autorise une détection d'environ 10exp4 cellules viables. Cette sensibilité pouvant âtre abaissée de 10 à 1 bactérie suite à la l'amplification in vitro du gène uidA par PCR (Polymerase Chain Reaction). La caractéristique moléculaire du gène conf »rant l'activité PYRase de S ; pyrogène a été réalisée. Ce gène, appelé pcp, pocède une phase de lecture ouverte de 645 nucléotides et code pour un polypeptide de 215 acides aminés (23135 Da). La sur-expression de ce pcp chez e. Coli a permis la purification et l'étude de son produit. La divergence nucléotidique du gène pcp de S ; pyrogènes par rapport à ses homologues bactériens et sa conservation au sein de cette espèce ont été confirmés âr PCR. Des sondes nucléiques spécifiques ont ainsi pu être définies à l'intérieur du gène pcp de S. Pyrogènes, permettant la mise au point d'un système d'amplification pour la détection de cet organisme.

The identification of microorganisms of medically or sanitary importance by molecular hybridization appeared in the 80's and is currently developing rapidly. The design of detection probes for bacterial species has been attempted rationally on basis of biochemical characters which are their own particulars: the β-glucuronidase which are their own particulars : the β-glucuronidase-glucuronidase (β-glucuronidase-GUR) of Escherichia coli and the pyrrolidone carboxylyl peptidase (PYRase) of Streptococcus pyogenes. The uid region of E. Coli chromosome, including β-GUR structural gene (uidA) and its main regulatory gene (uidR) , was proved to be a genetic marker specific of the species E. Coli and Shigella spp. (S. Boydii, S. Dysenteriae, S. Flexneri and S. Sonnei). The hybridization of probes directed against this single-copy genomic target permits to detect approxima tel y 104 viable cells, this sensitivity threshold being brought down to 10 to 1 bacteria following in vitro amplification of the uid. A gene by PCR (Polymerase Chain Reaction). The molecular characterization of the gene conferring PYRase activity to S. Pyogenes bas been performed. This gene, named pep, has an open reading frame of 645 nucleotides and encodes a polypeptide of 215 amino-acids (23,135 Da). The over-expression of pcp in E. Coli permitted the purification and the study of its product. The nucleidic divergence of the pcp gene from S. Pyrogenes with respect to its functional homologues among bacteria and its conservation within this species were confirmed by PCR. Specific nucleic probes have thus been defined withim the pcp gene of S. Pyogenes, allowing to set up an amplification system for the detection of this organism.