Étude de la chitinase d'une nouvelle espèce de Thermoactinomyces : application à l'obtention de polymères de chitosane de structure et de masse moléculaire contrôlée

Study of the chitinase from a new strain of Thermoactinomyces : use of that chitinase for obtaining chitosan polymers of controlled structure and molecular masses

• Auteur / Autrice : Bruno Brodel
• Direction : Philippe Debeire
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie Enzymatique, Bioconversion et Microbiologie
• Date : Soutenance en 1992
• Etablissement(s) : Compiègne
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Poids moléculaires

Acétylation

Viscosité

Polymères -- Détérioration

Microorganismes thermophiles

Chitinase

Chitine

Résumé

Le chitosane, obtenu par N-désacétylation chimique de la chitine, constitue le seul polysaccharide cationique naturel et peut être utilisé dans divers domaines d'application tels que les secteurs cosmétique, pharmaceutique ou médical. L'hydrolyse enzymatique du chitosane peut être réalisée grâce aux chitinases (EC 3. 2. 1. 14) ou aux chitosanases (EC 3. 2. 1. 132) mais les productivités en enzymes des souches de la littérature étaient trop faibles pour envisager une dépolymérisation enzymatique du chitosane à l'échelle industrielle. Nous avons isolé une nouvelle espèce bactérienne thermophile, appartenant au genre Thermoactinomyces, produisant une endochitinase qui hydrolyse le chitosane. Cette espèce produit une concentration maximale en chitinase quand elle est cultivée selon un procédé de fermentation de type fed-batch en utilisant la N-acétyl-D-glucosamine en tant qu'inducteur. La chitinase possède une masse moléculaire de 43. 000 g/mol et un point isoélectrique de 6,9. Elle possède un maximum d'activité à pH 4,0 et 70°C et présente une très bonne thermostabilité à 60°C, la rendant parfaitement adaptée à la dépolymérisation du chitosane. Nous avons effectué des hydrolyses de solutions de chitosane à 5 et 10% avec le surnageant de culture de la souche isolée et avons obtenu toute une gamme d'hydrolysats de chitosane de viscosité réduite et dont la masse moléculaire est comprise entre 83. 000 g/mol et 500. 000 g/mol. Nous avons donc démontré que des polymères de chitosane de viscosité et de masse moléculaire déterminées peut être facilement obtenus avec la chitinase de Thermoactinomyces en adaptant les paramètres de l'hydrolyse enzymatique. Nous avons étudié le mécanisme d'action de la chitinase et avons démontré que la vitesse initiale d'hydrolyse ne dépendait pas du taux de N-acétylation. En revanche, pour des temps plus longs, la chitinase agit préférentiellement sur du chitosane dont le taux de N- acétylation était de 60% alors qu'elle n'hydrolysait que difficilement le chitosane à 9% de N-acétylation. Nous avons enfin tenté d'analyser les oligosaccharides de fin de réaction enzymatique et avons démontré la présence des oligosaccharides suivants : GlcNAc, (G1cNAc)2, (G1cNAc)3 , (G1cNH2) ainsi que d'oligosaccharides de degré de polymérisation 2 et 3 constitués à la fois de résidus de G1cNAc et de résidus de GlcNH2.