Mise en évidence, purification, et clonage du gène, d'un facteur général de transcription de l'ARN polymérase B

• Auteur / Autrice : Bruno Cavallini
• Direction : Pierre Chambon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 1990
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN de transfert

Facteurs de transcription

Code génétique

Expression génique

Résumé

La compréhension des mécanismes de régulation de l'expression des gènes codant pour les protéines chez les eucaryotes passe par l'identification et la caractérisation des séquences d'ADN promotrices et des diverses protéines qui s'y lient. On distingue les séquences modulatrices et celles constituant le promoteur minimal. Ces dernières sont responsables du positionnement précis du site d'initiation de la transcription et de l'établissement d'un niveau basal de transcription. On reconnait 2 éléments de séquence dans les promoteurs minimaux des gènes de classe B. Un élément initiateur, et la séquence 5'-TATAAA-3' encore appelée TATA-box. Cette séquence placée 30 paires de bases en amont des sites d'initiation interagit avec le facteur général de transcription BTF1 (TFIID). Cette interaction est la 1ère étape de l'assemblage du complexe d'initiation, qui comprend outre BTF1, l'ADN, l'ARN polymérase B, et au moins 4 autres facteurs généraux de transcription. BTF1 est le seul facteur général de transcription à interagir de manière spécifique avec l'ADN, il joue un rôle clé dans l'établissement de la transcription basale et dans les phénomènes de transactivation. Il s'est révélé impossible de purifier le facteur BTF1 à partir de cellules d'eucaryotes supérieurs. Utilisant un test de transcription in vitro, nous avons mis en évidence le facteur TATA-box de S. Cerevisiae, BTF1Y. Puis nous l'avons caractérisé et purifié par fractionnement chromatographique. C'est un polypeptide de 27 kDa semblable au facteur BTF1 humain dans ses caractéristiques de liaison aux séquences TATA-box et d'initiation de la transcription. Nous avons cloné le gène l'encodant. Ce gène situé sur le chromosome VIII de S. Cerevisiae est unique et essentiel. Il code pour un polypeptide de 240 résidus, à caractère fortement basique, et qui ne montre aucune homologie avec une quelconque protéine connue. Nous avons remarqué un domaine dupliqué en tandem dans la partie COOH terminale de la protéine. Entre ces 2 régions répétées, une zone est susceptible d'adopter une conformation en hélice α qui présenterait sur une face une majorité de résidus basiques (Lys, Arg). L'importance de ces éléments structuraux est encore incertaine. Le clonage du gène codant BTF1Y a ouvert la voie au clonage du gène humain homologue. La protéine BTF1Y surexprimée dans E. Coli est d'ores et déjà disponible pour l'analyse détaillée de ses propriétés biochimiques et de son rôle dans les mécanismes d'initiation de la transcription des gènes de classe B.