Recherche Avancée

Thèse soutenue

Etude des mécanismes d'interaction ADN oriC-protéine DnaA

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Auteur / Autrice : Ahmed Landoulsi
Direction : Masamichi Kohiyama
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences biologiques. Microbiologie
Date : Soutenance en 1989
Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

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L'initiation de la réplication chromosomique chez E coli dépend de l'interaction entre l'origine de la réplication (oriC) et la protéine DnaA. Nous avons montré que cette protéine présente une spécificité pour oriC et que son affinité pour le miniplasmide oriC et plus forte lorsqu'il est surenroulé négativement que lorsqu'il est linéaire ou relaxé. Par la suite, nous avons montré, par deux techniques différentes, que la protéine DnaA induit une dénaturation dans la région d'oriC. Dans le but de mieux comprendre le mécanisme d'interaction DnaA-oriC nous avons étudié l'effet de l'état de méthylation des séquences 5'-GATC-3' sur le fonctionnement d'oriC et sur l'action de la protéine DnaA. Cette méthylation jouerait un rôle important dans l'interaction des protéines d'initiation avec oriC et également dans l'expression du gène dnaA. Nous avons montré que les plasmides oriC non méthylé et hémiméthylé sont répliqués avec la même efficacité mais inférieure à celle observée lorsque le plasmide oriC est méthylé. Nous avons également remarqué que le nombre de copies d'un plasmides oriC (pFH271= pBR 322+ le fragment oriC) est sensiblement réduit dans le mutant dam- ce qui pourrait être la conséquence de la diminution de la quantité de la protéine DnaA que nous avons observée chez ce mutant. Enfin, nous avons trouvé que l'initiation de la réplication des plasmides oriC méthylé, non méthylé et hémiméthylé a lieu au site oriC. De plus, nous avons montré que les plasmides oriC hémiméthylés sont répliqués de façon symétrique comme c'est le cas pour un plasmide méthylé. Comme la protéine DnaA est présente en quantité constante au cours du cycle cellulaire, nous avons pensé qu'elle est la cible d'un effecteur qui module son activité. Nous avons montré que cet effecteur est l'AMPc, qui est soumis à des régulations au cours du cycle cellulaire. Nous avons observé que la protéine DnaA a un site de fixation de l'AMPc presentant un KD de 1 µM. Cette interaction DnaA-AMPc se traduit par une stimulation de fixation de DnaA sur oriC ou mioC. L'AMPc protège la protéine DnaA contre une inactivation thermique et régénère la forme DnaA-ATP active. Enfin, nous avons aussi observé une réduction de la quantité de DnaA chez le mutant; le niveau normal de cette protéine peut être rétabli par la présence de l'AMPc dans le milieu de culture. On peut proposer deux hypothèses : soit cette interaction est nécessaire à la régulation du gène DnaA ; soit cette interaction stabilise la protéine in vivo. Ainsi, nous avons écarté la possibilité que la réplication du mutant Δcya puisse être du type ''réplication stable'', indépendante d'oriC et de toute synthèse protéique.