Caracterisation génétique et physiologique de la formiate déshydrogénase du système formiate-nitrate réductase chez Escherichia Coli

= Formate dehydrogenase genetic and physiological characterization of the Escherichia Coli formate-nitrate reductase system : cloning and regulation of the fdhD and fdhE gene expression

• Auteur / Autrice : Catherine Schlindwein
• Direction : Marie-Andrée Mandrand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 1989
• Etablissement(s) : Lyon, INSA
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : MIC – Microbiologie, RA 177 (INSA, Lyon1961-1982)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Formiates

Bactéries anaérobies

Escherichia coli

Résumé

Escherichia coli synthétise en anaérobiose et en présence de nitrate le système respiratoire formiate-nitrate réductase. Ce complexe membranaire, constitué de deux enzymes, une formiate déshydrogénase liée à l'accepteur artificiel d'électrons le phénazine méthosulfate (FDH-PMS) et une nitrate réductase, catalyse l'oxydation du formiate en gaz carbonique couplée à la réduction du nitrate en nitrite. Les deux mutants fdhD et fdhE sont spécifiquement dépourvus d'activité FDH-PMS et les loci correspondants sont localisés à la minute 88 sur le chromosome d'E. Coli. Nous avons isolé les gènes fdhD et fdhE par clonage à partir de deux banques d'ADN génomique. L'analyse de la carte de restriction des différents sous-clones obtenus, ainsi que celle de la position et du sens d'insertion du bactériophage mini-MudII à l'intérieur des deux gènes, ont permis de préciser la taille, la position et le sens de transcription de fdhD et fdhE. Les gènes fdhD et fdhE conduisent à l'expression de polypeptides de 30,5 kDa et 32 kDa respectivement dans le système maxicellules et dans le système ARN polymérase/promoteur du phage T7. Ces deux protéines fdhD et fdhE sont présentes exclusivement dans la fraction soluble et elles ne sont pas immuno précipitées par un antisérum spécifique de la FDH-PMS : en conséquence, elles ne peuvent correspondre à aucune des sous-unités membranaires de la FDH-PMS. Le gène fdhE, dont la séquence nucléotidique a été déterminée, code précisément pour une protéine hydrophile de 35 098 daltons. L'étude de l'expression des fusions de gènes et d'opérons a révélé que le gène fdhD était réprimé par l'oxygène et que le gène fdhE s'exprimait constitutivement en aérobiose et en anaérobiose, mais qu'il était induit par le métabolisme du nitrate en anaérobiose. Nous n'avons pas pu isoler de mutants de structure de la FDH-PMS par mutagenèse chimique ou par mutagenèse biologique. Cette constatation, ainsi que l'existence reconnue de deux isoenzymes nitrate réductases, permet de supposer l'existence de deux isoenzymes FDH-PMS : l'une s'exprimerait constitutivement et l'autre serait sous la dépendance de fnr. Dans cette éventualité, les deux gènes fdhD et fdhE seraient impliqués dans la synthèse des deux activités