Caractérisation de la contribution du proofreading et du mismatch repair à la réparation des mutations spontanées chez Bacillus subtilis

Caracterization of the contribution of proofreading and mismatch repair to the reparation of mutations in Bacillus subtilis

• Auteur / Autrice : Ira Tanneur
• Direction : Pierre Nicolas, Matthieu Jules
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies
• Date : Soutenance le 31/10/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Mathématiques et Informatique Appliquées du Génome à l'Environnement (Jouy-en-Josas, Yvelines) - Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé humaine (Jouy-en-Josas)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Julie Soutourina
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Tenaillon, Nathalie Campo, Sophie Abby
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Olivier Tenaillon, Nathalie Campo

Mots clés

Mots clés contrôlés

Réparation de mésappariement de l'ADN

Taux de mutation

Sciences -- Expériences

Évolution moléculaire

ADN -- Réplication

Mots clés libres

Réplication de l'ADN

Taux de mutation

Réparation des mésappariements

Proofreading

Evolution expérimentale

DNA replication

Mutation rate

Mismatch repair

Proofreading

Experimental evolution

Résumé

Les mutations spontanées sont au cœur des processus d'évolution. Elles se produisent principalement lors de la réplication de l'ADN par les ADN polymérases, qui sont susceptibles de commettre des erreurs. Ces mutations sont contrebalancées par deux systèmes de réparation : (1) une exonucléase associée à la polymérase - son activité est connue sous le nom de proofreading ; (2) le système de réparation des mésappariements (MMR). Discerner la contribution de ces deux systèmes au taux de mutation est crucial pour comprendre les processus évolutifs.Nous avons construit plusieurs souches de Bacillus subtilis avec un allèle déficient en exonucléase de l'ADN polymérase polC et/ou un allèle déficient d'un gène du MMR placé sous le contrôle d'un promoteur dépendant de l'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Pour valider les phénotypes hypermutateurs inductibles et caractériser les réponses à la concentration d'IPTG, les taux de mutation ont d'abord été évalués par des tests de fluctuation.Nous avons ensuite appliqué une stratégie d'accumulation de mutations (MA) suivie d'un séquençage du génome complet pour évaluer les taux de mutation à l'échelle du génome. Le principe des MA est d'imposer de manière répétée des goulots d'étranglement aléatoires à une population afin de maximiser la dérive génétique et donc de minimiser la sélection : les mutations sont donc accumulées de manière neutre. Des séquençages intermédiaires permettant de reconstruire l'histoire des mutations ont révélé que le taux de mutation de la souche ayant le taux de mutation le plus élevé avait diminué. Ces résultats remettent en question l'hypothèse de l'absence de sélection dans les expériences de MA avec des taux de mutation élevés.Nous avons obtenu pour chaque souche le taux et les spectres de mutation à l'échelle du génome, une de nos souches hypermutatrices atteignant un taux de mutation global ~ 1000 fois plus élevé que celui de B. subtilis sauvage. Parmi huit facteurs considérés comme potentiellement influents sur les spectres de mutation, la paire de référence, son orientation par rapport à la réplication et les nucléotides adjacents ont un effet significatif. La fréquence des types de mutations en fonction de l'activité de chaque système a révélé que le spectre de mutation est le moins uniforme lorsque l'exonucléase PolC est active et que le MMR ne l'est pas, ce qui suggère que la première génère des biais de mutation qui sont ensuite contrebalancés par le second.En parallèle, nous avons cherché à produire des outils pour l'évolution dirigée avec B. subtilis. L'augmentation inductible du taux de mutation est souhaitable pour l'évolution dirigée in vivo : elle permet d'accélérer l'évolution et de contrôler le rythme et l'ampleur de la production de diversité génétique. Un modèle (C++) permettant des simulations individu-centrées de l'évolution de souches hypermutatrices dans un chemostat, un système simple de culture continue, a montré que le contrôle du taux de mutation permettrait de gagner rapidement des mutations bénéfiques tout en acquérant pas ou peu de mutations délétères, ce qui n'est pas possible avec un taux de mutation continuellement élevé.Enfin, nous avons cherché à développer avec B. subtilis l'évolution continue assistée par les phages (PACE), un outil d'évolution dirigée qui n'a été mis en œuvre qu'avec E. coli. Nous nous sommes intéressé aux conditions de co-culture du phage lytique SPP1 et de B. subtilis en culture continue. Ces expériences ont révélé des comportements surprenants, tels que le maintien des phages sans chute de la densité optique (DO) indiquant la lyse, et l'émergence d'oscillations de la DO.Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent les taux de mutation spontanée, leur réparation et leur impact potentiel sur l'évolution. Ils pavent également la voie pour un développement des technologies d'évolution expérimentale et dirigée utilisant la culture continue et/ou les phages.

Spontaneous mutations are at the heart of evolutionary processes, and the rate at which they occur is a crucial parameter. Mutations mostly occur during DNA replication, carried out by dedicated proteins known as polymerases, which are susceptible to errors. These mutations are counterbalanced by two dedicated repair systems: (1) an exonuclease associated with the replicative polymerase - its activity is known as proofreading; (2) the mismatch repair system (MMR). Discerning the contribution of each of these systems to the mutation rate is therefore crucial to understanding evolutionary processes.Here, we constructed several Bacillus subtilis strains with a proofreading-deficient allele of DNA polymerase polC and/or a deficient allele of an MMR gene placed under the control of an isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)-dependent promoter. To validate the inducible hypermutator phenotypes and characterize responses to IPTG concentration, mutation rates were first assayed through fluctuation tests.We then applied a mutation-accumulation (MA) strategy followed by whole-genome sequencing to assess genome-wide mutation rates. The premise of MA is to enforce repeated random bottlenecks on a population to maximize genetic drift and thus minimize selection: mutations are thus accumulated in a theoretically neutral way. Intermediate sequencings enabled for a reconstruction of mutational histories and detection of changes in mutation rate. They revealed that the mutation rate of the strain with the highest mutation rate had decreased. These findings challenge the hypothesis of the absence of selection in MA experiments for high mutation rates.We were able to obtain the whole-genome mutation rate and spectra of each of the strains. Our strongest hypermutating strain reached a global mutation rate ~ 103 higher than that of wild-type B. subtilis. Among eight factors thought to be potentially influential on the mutation spectra, only the reference pair, its orientation with regards to replication, and neighboring nucleotides had a significant effect. We also identified the frequency of different types of mutations depending on the activity (or lack thereof) of each system, revealing that the mutation spectrum is the least uniform when PolC exonuclease is active and the MMR is not, indicating that the former generates mutation bias that are then counteracted by the latter.In parallel, we sought to produce tools for directed evolution with B. subtilis. Increasing the mutation rate in an inducible manner is desirable for in vivo directed evolution: it allows for faster evolution, but also makes it possible to control the timing and magnitude of the production of genetic diversity. We developed a model (C++) enabling individual-based simulations of the evolution of hypermutating strains in a chemostat, a simple continuous culture system. These simulations showed that controlling the mutation rate would make it possible to rapidly gain beneficial mutations while acquiring few or no deleterious mutations, which is not possible with a continuously high mutation rate.Finally, we sought to utilize with B. subtilis Phage-Assisted Continuous Evolution (PACE), a directed evolution tool that uses the properties of phages to allow continuous evolution and was so far only implemented with E. coli,. Thus, we were interested in co-culture conditions for the lytic phage SPP1 and B. subtilis together in a continuous culture system. The experiments carried out revealed surprising behaviors, such as phages maintaining in the absence of visible optic density (OD) drop indicative of lysis, and the emergence of oscillations in OD.These results provide a better understanding of the mechanisms underlying spontaneous mutation rates, their repair and their potential impact on evolution. They also pave the way for the development of experimental and directed evolution technologies using continuous culture and/or phages.