Méthode d'étude par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire de l'activité enzymatique de l'hexokinase au sein de cellules vivantes (érythrocytes) utilisant le désoxy-2 glucose comme substrat

Nuclear magnetic resonance spectroscopy study of hexokinase enzymatic activity in intact erythrocytes with 2-deoxyglucose as substrate

• Auteur / Autrice : Farid Halabi
• Direction : Jean-Paul Seguin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie enzymatique, bioconversion, microbiologie
• Date : Soutenance en 1988
• Etablissement(s) : Compiègne
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Environnement

Spectroscopie de la résonance magnétique nucléaire

2,3-Diphosphoglycérate

Phosphorylation

Érythrocytes

Hexokinase

Désoxyglucose

Glycolyse

Cinétique enzymatique

Enzymes

Résumé

Par RMN du phosphore-31, nous avons suivi la production de désoxy-2-glucose-6 phosphate dans les hématies intactes, incubées à 35°C, avec du désoxy-2 glucose utilisé à concentration saturante vis-à-vis de l'hexokinase. Parallèlement nous avons suivi la disparition en fonction du temps des 2,3 diphosphoglycerate et de l'ATP ainsi que la production des phosphates inorganiques. Ce travail nous a donc permis de mettre au point un protocole de mesure de la vitesse de phosphorylation du désoxy-2 glucose par l'hexokinase dans des hématies intactes. La variabilité interindividuelle de cette vitesse a été testée avec le sang de dix sujets sains de sexe masculin, elle n'est que de 30 %. Par contre pour des sujets de sexe féminin, nous avons observé des variations de 250 %. Toutefois une constance de cette vitesse est observée pour les femmes ménopausées et de plus pour les femmes soumises à un contraceptif oral, nous avons distingué une différentiation de la vitesse suivant la nature de la pilule. Aucune relation simple entre ce paramètre et les taux hormonaux mesurés dans le plasma n'a pu être établie, par contre ce paramètre montre une tendance à la corrélation avec la concentration en 2,3 DPG. Pour des sujets anémiés soumis à un traitement de dialyse, cette vitesse est environ 2 ou 3 fois plus élevée ce qui traduit un métabolisme du désoxy-2 glucose plus rapide qui est du à un taux élevé de réticulocytes chez ces sujets. La mesure des vitesses de phosphorylation pour des concentrations en sucre variable et non saturante, nous a permis de mesurer les paramètres cinétiques apparents (K'm et V'max) de l'hexokinase dans son milieu naturel.

With 31 P NMR, we have followed the 2-deoxyglucose (2DG) production in human intact erythrocytes incubated at 35 °C with 2-deoxyglucose at saturating concentration towards hexokinase. At the same time we have followed time course of intracellular metabolites (2, 3-DPG, Pi, ATP). So this work has allowed us to establish a measurement protocol of the 2 DG phosphorylation rate by hexokinase in intact red blood cells. This rate parameter was tested on the blood of 10 healthy male subjects, his variation is only 30%. Nevertheless it shows 250% of variation for the blood of healthy female subjects. However a constancy of the rate was observed on menopausal women and differentiation of this parameter for women under oral contraceptive with respect to the contraceptive rapture. We haven't observed any relation between the hormonal plasma level and the rate, but it appear that this parameter may be related linearly with the concentration of 2,3-DPG. For anaemic subjects, this parameter is 2 or 3 times higher which translate a rapid 2DG metabolism related to reticulocyte high level for this subjects. The measurement of the phosphorylation rates for variable and no saturing concentrations, allows us to determine the apparent hexokinase kinetic parameters (K'm et V'max) in this natural milieu.