Étude des mécanismes de photorégulation de la phosphoénolpyruvate carboxylase et de la malate déshydrogénase à NADP des feuilles de sorgho

Study of photoregulation mechanisms of phosphoenolpyruvate carboxylase and Nadp malate dehydrogenase from sorghum leaf

• Auteur / Autrice : Claude Cretin
• Direction : Pierre Gadal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences naturelles
• Date : Soutenance en 1987
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN complémentaire

Sorghum

Mots clés libres

Photorégulation

Banque génomique

Malate déhydrogénase à NADP

Phosphoénolpyruvate carboxylase

Traduction in vitro

Résumé

La phosphoénolpyruvate carboxylase (E. C. 4. 1. 1. 31) (PEPC) et la Malate Déshydrogénase à NADP (E. C. 1. 1. 1. 82) (MDH à NADP) sont deux enzymes clé du métabolisme photosynthétique des plantes de type C4. Dans le cytoplasme des cellules du mésophylle, la PEPC catalyse la réaction de β-carboxylation du PEP en acide oxaloacétique; celui-ci est réduit en malate dans les chloroplastes par la MDH à NADP. Le verdissement des feuilles de Sorgho (Sorghum vulgare F, cv. Tamaran FNK 140) s'accompagne d'une forte augmentation de l'activité enzymatique de ces deux biocatalyseurs. Ce travail a consisté en une étude des mécanismes de la photorégulation de la PEPC et de la MDH à NADP. Par traduction in vitro des ARNm poly (A+) des feuilles de Sorgho nous avons pu montrer, dans les deux cas, une augmentation de l'activité traductionnelle des ARNm spécifiques au cours du verdissement. De plus, dans le cas de la MDH, nous avons mis en évidence l'existence d'un précurseur possédant un peptide de transit d'environ 2,5 kDaltons intervenant dans le transport de la sous-unité de la MDH dans les chloroplastes. La construction et le criblage d'une banque d'ADN complémentaire dans le vecteur d'expression lambda gt11 à l'aide d'anticorps polyclonaux a permis d'isoler deux ADNc pour les deux enzymes. Ces clones ont été caractérisés par des expériences d'hybridation aux ARNm poly (A+) de feuilles vertes de Sorgho et traduction in vitro des ARNm sélectionnés. Grâce à ces sondes homologues, nous avons estimé la taille de l'ARNm de la PEPC à 3,4 kb et celui de la MDH à 1,6 kb, par la technique de Northern. De plus, nous avons pu montrer que le verdissement des feuilles s'accompagne d'une accumulation de ces ARNm. Enfin, une banque génomique a été construite dans le vecteur lambda EMBL4 à partir de fragments MboI de l'ADN de feuilles de Sorgho. 70 clones ont été sélectionnés par criblage de la banque à l'aide de la sonde d'ADNc PEPC. Un clone génomique (lambda CP46) a été plus particulièrement caractérisé. L'établissement de sa carte de restriction a permis de localiser une région de 7,5 kb couvrant tout le gène de la PEPC ainsi que les régions régulatrices et non codantes en 5' et en 3' du gène.

Phosphoenolpyruvate carboxylase (E. C. 4. 1. 1. 31) (PEPC) and NADP-Malate Dehydrogenase (E. C. 1. 1. 1. 82) (NADP-MDH) are two key enzymes involved in the photosynthetic pathway of C4 plants. In the cytoplasm of mesophyll cells, PEPC catalyses the β-carboxylation of PEP giving rise to oxaloacetate which is then translocated into chloroplasts and reduced to malate by NADP-MDH. During the greening process of Sorghum leaf (Sorghum vulgare F, cv. Tamaran FNK 140), a light-dependent increase in enzyme activity occurs for both enzymes. The present work is devoted to the study of photoregulation mechanisms of PEPC and MDH. By in vitro translation of Sorghum leaf poly (A+) mRNA and immunoprecipitation using specific antibodies, we have shown a light-dependent increase in the translational activity of both mRNAs. Furthermore, a precursor form was found for the MDH with a transit peptide of about 2. 5 kDaltons; results suggested that the peptide was processed during the subunit translocation into the chloroplast. We have constructed a cDNA library from Sorghum leaf poly (A+) mRNA in the expression vector lambda gt11. Using polyclonal antibodies raised against PEPC and MDH, we isolated two cDNA clones for these enzymes, which were subsequently characterized by hybrid-selection translation experiments. Sizes of PEPC and MDH mRNAs were estimated by Northern blotting to be 3. 4 kb and 1. 6 kb respectively. It was shown that a light-dependent accumulation of both PEPC and MDH mRNAs occurred during the greening of Sorghum leaves. Finally, we constructed a genomic library in the phage lambda EMBL4 from MboI restriction fragments of Sorghum leaf DNA. Using the PEPC cDNA, we isolated 70 positive clones from the library. One of them (lambda CP46) has been characterized by establishing its restriction map. We could localize a 7. 5 kb region in the clone containing the entire PEPC gene. We also showed that lambda CP46 genomic clone contained the putative regulatory and non-coding regions at 5’ and 3' ends of the gene.