Étude du plasmide pKD1 et développement de systèmes d'expression de gènes chez la levure Kluyveromyces lactis

Study of the yeast plasmid pKD1 and development of gene expression systems in Kluyveromyces lactis

• Auteur / Autrice : Xin Jie Chen
• Direction : Hiroshi Fukuhara
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques
• Date : Soutenance en 1987
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)
• Jury : Président / Présidente : Michel Jacquet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hiroshi Fukuhara, Michel Jacquet, Laura Frontali, Michel Guérineau, Claude Gaillardin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Expression génique

Plasmides

Mots clés libres

Transformation de K. Lactis

Vecteurs de K. Lactis

Fusion de gènes

Phosphotransférase de 3'-aminoglycoside

β-galactosidase

Résistance au G418

Promoteurs de levure

Levure Kluyvéromyces lactis

Plasmide de levure pKD1

Résumé

Le nouveau plasmide circulaire, pKD1, isolé chez Kluvveromvces drosophilarum présente une organisation de son génome similaire à celle du plasmide 2 micron chez Saccharomyces cerevisiae, cependant ils ont très peu d'homologie au niveau de la séquence nucléotidique. L'analyse de la séquence nucléotidique de pKD1 montre qu'il a une taille de 4757 paires de bases, qu'il possède trois phases de lecture ouvertes (A, B et C) et une paire de répétitions inversées de 346 paires de bases. La molécule de pKD1 existe sous deux formes isomériques, ceci étant dû à une recombinaison intramoléculaire au niveau des répétitions inversées. La séquence protéique de la phase de lecture ouverte A a une homologie significative avec la protéine recombinase FLP du plasmide 2 micron. Le plasmide pKD1 a été transféré chez Kluyveromyces lactis où il peut être maintenu stablement sans pression de sélection. Nous avons développé un système de transformation efficace chez K. Lactis en utilisant des plasmides dérivés de pKD1. Cela nous a permis aussi de localiser les fonctions de pKD1 (origine de réplication, FLP, REP). De nombreux vecteurs (vecteurs de clonage, vecteurs d'expression, vecteurs pour la détection de promoteur et vecteurs de sécrétion) ont été construits en utilisant des séquences de pKD1 et différents marqueurs génétiques: le gène URA3 de S. Cerevisiae, le gène de résistance à la kanamycine de Tn903 et le gène lacZ d'E. Coli). Nous avons également développé un nouveau système de fusion de gènes à partir du gène de résistance à la kanamycine de Tn903, ce qui nous a permis d'analyser plusieurs promoteurs de S. Cerevisiae et K. Lactis.

The new circular plasmid, pKD1 (or 1. 6µ), isolated from Kluyveromyces drosophlilarum, has a genome organization analogous to that of the 2 micron plasmid from Saccharomyces cerevisiae, although these plasmids share little sequence homology. Nucleotide sequence analysis of pKD1 revealed that this 4757 base-pair long plasmid contained three major open reading frames, A, B, and C, and a pair of inverted repeats of 346 base-pairs. The molecule exists in two isomeric forms generated by internal recombination at these repeats. The amino acids sequence encoded by open reading frame A has significant homology with the FLP recombinase of the 2 micron plasmid. The plasmid pKD1 can be transferred to Kluyveromyces lactis where it can be stably maintained. Using pKD1-derived recombinant plasmids, we developed an efficient transformation system for K. Lactis. This also allowed us to map the functions of pKD1 (replication origin, REP, FLP). A series of useful cloning vectors, expression vectors, promoter-probe vectors and secretion vectors were constructed using the pKD1 sequence and three different genetic markers: URA3 gene of S. Cerevisiae, kanamycin resistance gene of Tn903, and LACZ gene of E. Coli. A new gene fusion system was developed using the kanamycin resistance determinant of Tn903 as the indicator gene; in this way several promoters from S. Cerevisiae and K. Lactis were analysed.