Étude et clonage d'une mutation conferant la résistance au vanadate à la H⁺-ATPpase plasmique de Saccharomyces cerevisiae

Vanadate resistance of the plasma membrane H⁺-ATPase from Saccharomyces cerevisiae kinetic studies and cloning

• Auteur / Autrice : Philippe Tuduri
• Direction : Jean-Luc Rossignol
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance en 1986
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Clonage

Vanadates

Saccharomyces cerevisiae

Ascomycètes

Mots clés libres

Complémentation fonctionnelle

Régulation physiologique

H⁺-ATPpase

Résumé

La membrane plasmique des champignons et des plantes contient une H⁺-ATPase dont la structure et le mécanisme ressemblent fortement aux Ca²⁺-ATPases du reticulum sarcoplasmique et à la Na⁺/K⁺-ATPase des membranes plasmiques des cellules des mammifères. Des études de cinétique ont montré que le vanadate inhibe l'ATPase plasmique de Saccharomyces cerevisiae selon un mode hyperbolique. Des études physiologiques ont révélé une diminution de l'activité de l'enzyme en fin de croissance exponentielle en milieu riche glucosé. Cette diminution d'activité n'affecte que l'activité de l'enzyme et non ses caractéristiques cinétiques (Km pour le MgATP, I 50 pour le vanadate,. . . ). Elle devrait correspondre à une régulation de la quantité d'enzyme active. La mutation pmal confère à la H+-ATPase plasmique de S. Cerevisiae la résistance in vitro au vanadate. Cette résistance s'exprime à tous les stades de la croissance en milieu riche glucosé. L'analyse des phénotypes de résistance des souches sauvage et mutante à certains inhibiteurs alcalins hydrophobes, tels que le bromure d'éthidium et les diguanidines, a permis de mettre au point un premier crible de sélection in vivo pour le clonage par complémentation du gène PMA 1. Cette première étape permet de réduire considérablement le nombre de transformants à examiner in vitro pour la sensibilité au vanadate de leur activité ATPasique. Des expériences de complémentation fonctionnelle ont permis d'obtenir des colonies présentant le phénotype Pma⁺. Ce phénotype s'est révélé très stable pour tous les clones étudiés suggérant une complémentation après intégration des fragments d'ADN clonés. La localisation des fragments intégrés sur le chromosome VII a permis de définir deux loci : l'un correspondant au gène de structure (PMA1) et le deuxième étant situé à 19 CM de PMA 1. L'étude de la carte de restriction des fragments capables de complémenter la mutation pmal par intégration à son locus permet de situer cette dernière dans la partie carboxy terminale de la protéine codée par le gène de structure de l'ATPase. Les sites potentiels d'action du vanadate ont été analysés par l'étude de la séquence du gène de la H⁺-ATPase.

The plasma membrane H⁺-ATPase from fungi and plants are very similar. Their structure and mechanism are very close to reticulum sarcoplasmic Ca²⁺-ATPase and plasma membrane Na⁺/K⁺-ATPase from mammalien cells. Kinetic studies show that vanadate gives an hyperbolic inhibition of the ATPase activity. Physiologie studies of the ATPase specific activity during growth on glucose point out a decrease of the enzyme activity at the end of exponential growth. This decrease does not modify the kinetic parameters (Km for MgATP, I 50 for vanadate), and seems to be due to a regulation of the active enzyme amount. The pmal mutation confers to the S. Cerevisiae plasma membrane ATPase an in vitro vanadate resistance and an in vivo ethidium bromide resistance. This phenotype exists at every growth state in a glucose medium. The difference between in vivo phenotype of wild type and mutant strains allows a first screen which decreases the clone number to be tested for in vitro vanadate effect. Complementation experiments give Pma⁺ transformants, but this phenotype is very stable in every case. Such a stability indicates a complementation after integration of DNA fragments. This integration localisation on chromosome VII displays two different loci : the structural gene (PMA1) and the second one linked to PMA1 at 19 CM. The plasmids restriction maps indicate that the mutation is located in the protein carboxy end. The primary structure analysis enables us to pos tulate a potential vanadate site in this part of the plasma membrane ATPase.