Hétérogénéité des systèmes de transport des monosaccharides de la bordure en brosse entérocytaire : effet de la température et des cations

Heterogeneity of monosaccharide transport system in intestinal brush border : temperature and cation effect

• Auteur / Autrice : Edith Brot-Laroche
• Direction : Directeur de thèse inconnu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences naturelles
• Date : Soutenance en 1986
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cations

Transport biologique

Intestins

Microvillosités

Sodium

Mots clés libres

Cotransport

Vésicules

D-glucose

Résumé

L'accumulation intracellulaire du D-glucose (DG) est due à un transport actif secondaire, activé et énergisé par un gradient électrochimique de Na. Les implications cinétiques de ce double rôle ont été compilées dans un modèle allostérique général basé sur des expériences avec le tissu intestinal intact. Dans ces conditions le Na est un activateur facultatif du cotransport Na /soluté. Avec les vésicules de bordure en brosse isolées (VBB), la prise est au contraire, très fortement diminuée en absence de Na. Pour concilier les résultats obtenus avec ces deux méthodologies, Alvarado (1982) a introduit le concept de Na activateur obligatoire. Il postulait l'existence d'un réservoir de Na adjacent à la face externe de la bordure en brosse (BB) dont la réalité physiologique a été récemment démontrée (Lucas et Cannon 1983). Enfin le modèle suggérait que le potentiel membranaire affecte la translocation et non l'affinité du transporteur. Sur la base d'un seul système de cotransport Na/D-G, notre objectif a été de démontrer le caractère obligatoire du Na. Pour cela nous avons utilisé des VBB qui permettent de contrôler la composition des milieux intra- et extravésiculaire et notamment leur composition cationique. En absence de Na, la prise de DG est supérieure à celle du L-glucose marqueur classique de diffusion. La séquence d'activation étant : Na » Li > K = sorbitol, ces résultats indiquent, soit que le Na est un activateur facultatif, soit que l'on doive remettre en cause l'homogénéité du transport de D-G dans la BB. Pour tester cette deuxième possibilité, nous avons utilisé une approche cinétique. Les courbes de saturation en substrat ont été analysées par régression non linéaire à partir d'une équation modèle qui contient une ou deux composantes saturables (michaeliennes), et une diffusion. En présence de Na, la prise du D-G a trois composantes : (1) une diffusion, (2) un système de transport S-I de Km=O. 4 mM et de Vm=335 pmoles mg-1 prot. Sec-1); (3) un système S-II de Km= 24mM et de Vm=2223 pmoles. S-Il mais non S-I subit une transition d'activité lorsque la température augmente de 25° C à 35° C et est inhibé par la cytochalasine B. Nous avons exclu la possibilité d'une explication de l'existence de S-II par la présence d'une contamination de membrane basolatérale dans nos préparations de VBB. L'alpha-méthyl-D-glucopyranoside (AMG) est un substrat spécifique de S-I. Il en possède les caractéristiques cinétiques: forte affinité (Km = 2 mM), faible capacité et insensibilité à la température. La phlorizine est un inhibiteur compétitif de ce transport d'AMG qui est par contre insensible à la cytochalasine B. Ces résultats montrent que le S-I et le cotransport Na/DG «classique»·sont équivalents. L'AMG n'est transporté qu'en présence de Na qui s'avère, par·conséquent, être un activateur obligatoire du cotransport. Le transport. D'AMG est sensible au potentiel de membrane qui modifie le paramètre Vm et non le Km. Ces résultats apportent donc la réponse expérimentale aux préd1ctions du modèle de 1982. Nous voudrions maintenant comprendre quel est le rôle de S-II pour l'absorption du glucose. S-II semble être un système modulable qui pourrait jouer un rôle important dans la physiologie normale de l'animal.

Intestinal Na/D-glucose cotransport across the brush border membrane (BBM) is generally thought to involve a single carrier system. The energy for this uphill transport comes from the dissipation of an inward-directed Na gradient. The mechanism of this cotransport system has been described in terms of a general allosteric model based on results obtained with intact-tissue preparations. Na is described as a nonobligatory activator of solute transport meaning that, in the absence of Na, the transport capacity is identical to that in its presence. Ln contrast, experiments with BBM vesicles indicate that D-G uptake is drastically reduced when Na is absent. To reconcile experimental results obtained with either preparation, Alvarado and Lherminier (1982) postulated that (a) Na behaves as an obligatory activator meaning that in the absence of this cation the D-G transport rate is nil and (b) that zero Na conditions cannot be obtained with intact tissue preparations because of a Na reservoir present at the external face of the BBM. The existence of the reservoir was later demonstrated by Lucas (1983). It was also predicted that the membrane potential has an effect on the permeability parameter but not on the affinity of the transport system. The unequivocal demonstration of the hypothesis that Na is an obligatory activator of D-G transport requires the use of BBM vesicles because the composition of both the intra- and extravesicular media can be fully controlled only with this preparation. We have shown that D-G uptake is mediated by a stereospecific (D-G » L-Glucose) saturable transport system with the following activating sequence: Na >> Li > K = sorbitol (absence of cation). These results could be interpreted in two ways: either Na is a nonobligatory activator of D-G transport or there is heterogeneity of the transport systems. To test the second hypothests we measured the kinetics of D-G saturation using a non-linear regression analysis with an equation containing a diffusional term and either one or two saturable terms. In the presence of Na, apart from diffusion, we found at least two D-G transport systems : one ( S-I) is a high-affinity (Km=O. 4 mM) low-capacity transport system which is insensitive to temperature changes from 25°C to 35°C. The second system (S-II) is a low-affinity (Km=24 mM), high-capacity transport system which is highly sensitive to temperature. There is a transition, interpreted in terms of membrane fluidity. S-11 (but not S-I) is sensitive to cytochalasine 8. Substrate specificity studies indicate that alpha-methyl-D-glucoside (AMG) is a substrate spécific for S-I. In effect, the kinetic analysis of AMG transport shows that a single transport system is involved which posesses the main characteristics of S-I: it is a high-affinity (Km=2mM), low-capacity, temperature-insensitive system. Moreover, phlorizin Is a fully competitive inhibitor of AMG transport whereas cytochalasine Bis inert. Taken together, these findings indicate that S-I is identical to the ''classical'' Na/D-G cotransport system. . Since AMG transport does not occur in the absence of Na, we conclude that Nais an obligatory activator of the Na/D-G cotransport system. Using AMG as the substrate we showed that Vm, but not Km, 1s affected by the membrane potentta1, therefore demonstrat1ng the two main postulates of the modified model for Na/solute cotransport (Alvarado 1982). More work is needed to understand the significance of S-II for D-G absorption by the intestine. Ls S-II a dead end of evolution or rather, is it an important modulable transport system, responsible for the physiological adaptation of the animal to certain nutritional conditions ?