Décryptage de l'adhésion du phytoplasme de la flavescence dorée aux cellules de son insecte vecteur

par Francesca Canuto

Projet de thèse en Microbiologie -immunologie

Sous la direction de Xavier Foissac.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé , en partenariat avec Biologie du Fruit et Pathologie (laboratoire) et de Mollicutes (equipe de recherche) depuis le 21-09-2020 .


  • Résumé

    1.Caractérisation de l'activité lectine de l'adhésine VmpA et comparaison de VmpA du phytoplasme de la flavescence dorée et du phytoplasme PGYA non transmissible pour montrer si cette interaction de type lectine est impliquée dans la spécificité de vection 2. Identification de(s) la protéine(s) X d'E. variegatus interagissant avec la VmpA, par les techniques far-western et identification des protéines par spectrométrie de masse et colonne d'affinité. Stratégie alternative : Inhibition de l'expression du gène codant la chaine lourde de la clathrine et une ou plusieurs sous-unités de la protéine AP-2 et infection par les phytoplasmes, suivi de la charge bactérienne dans les insectes en fonction du temps et de leur capacité à transmettre les phytoplasmes aux plantes pour tester l'hypothèse d'une endocytose clathrine dépendante dans les cellules d'Escelidius variegatus en culture. 3. Optimisation de l'inhibition de gènes intestinaux par la technique de RNAi utilisant la voie d'ingestion pour administrer les ARNdb dans le but de cibler la barrière intestinale chez les insectes E. variegatus et S. titanus. Inhibition de la synthèse d'ARNm ciblés par RNAi au niveau des glandes salivaires en utilisant la micro-injection des ARNdb dans l'abdomen des insectes (déjà mis au point chez E. variegatus). Effet sur la colonisation des glandes salivaires et la transmission. 4. Validation des interactions spécifiques protéine VmpA/protéine X d'insecte en système ex vivo et in vivo Mesure de l'adhésion des billes-VmpA et de la co-localisation du complexe VmpA/protéine X (microscopie à fluorescence et FRET) chez les protéines S2 exprimant la protéine X. Mesure de l'inhibition d'adhésion de billes-VmpA aux cellules d'E. variegatus en culture et de rétention des billes après ingestion par l'insecte vivant, en conditions de suppression de l'expression du récepteur par interférence ARN. Mesure de l'effet sur la transmission du phytoplasme par Scaphoideus titanus et E. variegatus.

  • Titre traduit

    Deciphering of flavescence dorée phytoplasma adhesion to cells of its insect vector


  • Résumé

    1. Identification of VmpA adhesin lectin activity and comparison VmpA of Flavescence dorée phytoplasma and PGYA phytoplasma to show whether this lectin-like interaction is involved in vector specificity 2. Identification of protein (s) X of Eucelidius variegatus interacting with VmpA using several methods: yeast double hybrid, far-western / protein identification by mass spectrometry and affinity column with mannose (and other sugar)-specific lectin agarose. If we fail to identify the insect protein interacting with the VmpA protein, we will test the hypothesis of phytoplasma entry using clathrin-dependent endocytosis derived from the first results of VmpA pull-down / protein proteins. E. variegatus: inhibition of clathrin heavy chain gene expression and one or more subunits of AP-2 protein and phytoplasma infection, followed by bacterial titer in insects as a function of time and their ability to transmit phytoplasmas to plants. 3. Optimization of intestinal gene inhibition by the RNAi technique using the ingestion pathway to deliver dsRNAs in order to target the intestinal barrier in E. variegatus and S. titanus insects. Inhibition of RNAi-targeted mRNA synthesis in the salivary glands using micro-injection of dsRNAs in the insect abdomen (technique already developed). Impact on the salivary glands colonization and phytoplasma transmission. 4.Validation of specific VmpA protein / insect X protein interactions in ex vivo and in vivo system: - Heterologous expression of the protein x on the surface of the Drosophila S2 cells. Measurement of the adhesion of fluorescent beads coated with VmpA (phytoplasma of flavescence dorée and non-transmissible phytoplasme PGYA) and co-localization of the VmpA / protein X complex (fluorescence microscopy and FRET). - VmpA beads adhesion inhibition tests to E. variegatus in culture whose production of the protein interacting with the VmpA protein has been inhibited by RNA interference - Ingestion of VmpA beads by insects treated with RNAi (oral) to demonstrate the in vivo interaction of VmpA with protein X 5. Verification of the role of the insect VmpA / protein X interaction in transmission: The acquisition of phytoplasmas will be measured by quantitative PCR on batches of insects treated or not with the dsRNA targeting gene x. Transmission efficiency to the plant will also be measured. This strategy will be applied to E. variegatus and S. titanus