Les sources de peptides antigéniques pour la voie du CMH de classe I

The sources of antigenic peptides for the MHC class I pathway

• Auteur / Autrice : Maria Tovar fernandez
• Direction : Robin Fahraeus
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Oncogénèse (ed 561)
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 08/11/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : ED 561 Hématologie, oncogenèse et biothérapies
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sylvain Cardinaud, Nuala Mooney, Evelina Gatti, Arnaud Moris, Robin Fahraeus
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Evelina Gatti, Arnaud Moris

Mots clés

Mots clés libres

Présentation de l'antigène restreint du CMH de classe I

Autophagie

Agrégats de protéines

EBNA1 codé par EBV

Peptides dérivés d'intron présente sur la molécule MHC-I

Traduction alternative non canonique

Traduction d'ARNm pré épissés

Machinerie de traduction alternative

MHC class I restricted antigen presentation

Autophagy

Protein aggregates

EBV-encoded EBNA1

Intron-derived peptides on MHC-I molecule

Non-canonical alternative translation

Translation of pre-spliced mRNAs

Alternative translation complex

Résumé

Un élément clé de la capacité du système immunitaire à faire la distinction entre le soi et le non-soi est la présentation de peptides par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH-I). La présentation des peptides dérivés de l'intron par les molécules CMH-I pose la question de l'origine des peptides antigéniques pour la voie CMH-I. Une meilleure connaissance de l'origine des néo-antigènes conduirait à une meilleure compréhension de l'évasion immunitaire virale et cancéreuse. Je me suis intéressée à deux sources différentes de peptides antigéniques. Premièrement, à l'autophagie en tant que mécanisme de dégradation des protéines et deuxièmement, aux produits de traduction pionniers dérivés de l'épissage des ARN pré-messagers.1) L'autophagie joue un rôle essentiel dans l'homéostasie cellulaire, en aidant notamment les cellules à se débarrasser d'agrégats protéiques nocifs qui peuvent s'accumuler et causer des troubles neurodégénératifs. La réponse immunitaire face aux cellules porteuses d'agrégats protéiques est relativement inconnue et il existe peu de connaissances du processus autophagique des peptides antigéniques dédiés à la voie de classe I du CMH. Pour évaluer la présentation des peptides antigéniques dérivés de l'autophagie par la voie CMH-I, nous avons utilisé des cellules T CD8+ (OT-1) reconnaissant spécifiquement l'épitope SL8 (SIINFEKL) de l'ovalbumine de poulet (OVA) présenté par les molécules murines Kb du CMH-I. Nous avons évalué deux substrats potentiels pour l'autophagie via la fusion de la séquence ovalbumin-SIINFEKL, soit à la protéine polyglutamine (PolyQ) qui a tendance à s'agréger, soit aux séquences EBNA1 codées par le virus Epstein Barr. La suppression de l'autophagie par l'inhibition d'Atg5 et Atg12 n'a pas affecté la présentation des peptides dérivés de la protéine EBNA1, alors qu'elle a réduit la présentation des peptides antigéniques dérivés d'OVA, ou OVA fusionné à la séquence PolyQ agrégée. Étonnamment, la fusion de l'ovalbumine avec la répétition glycine-alanine (GAr) d'EBNA1 (GAr-OVA) a empêché la présentation de peptides d'OVA. Ces données suggèrent une présentation de peptides antigéniques dépendants du substrat pour la voie de classe I du MHC via l'autophagie et illustrent un nouveau mécanisme à médiation virale pour l'évasion immunitaire de la présentation d'antigènes dépendants de l'autophagie. 2) Au fil du temps, l'idée selon laquelle les peptides antigéniques seraient uniquement issus de la dégradation de « vieilles » protéines a été remplacée par l'hypothèse selon laquelle les peptides antigéniques seraient également dérivés de peptides nouvellement synthétisés, via un événement de traduction alternative non-canonique qui se produit avant l'épissage de l'ARNm. Cela expliquerait la présence de peptides dérivés de l'intron sur les molécules CMH-I. En effet, nous avons observé que l'expression de la séquence SIINFEKL présente dans le second intron du gène beta-globine déclenchait la prolifération des cellules T CD8+ (OT-1). Par la technique du PLA (Proximity Ligation Assay) nous avons observé une augmentation des peptides SIINFEKL dérivés d'ARNm pré-épissé après traitement avec l'inhibiteur d'épissage Isoginkgetin et un inhibiteur du protéasome MG-132. Pour caractériser ce complexe de traduction alternative, nous avons utilisé la technique de fractionnement de polysome pour identifier les ribosomes associés à l'ARNm pré épissé. L'ARNm-beta-Globine pré épissé se trouve associé aux polysomes légers, contrairement à l'ARNm-beta-Globine épissé qui est présent dans les fractions polysomales lourdes. Nous avons également observé par PLA, l'interaction entre la protéine ribosomale L5 (RPL5) et la séquence peptidique FEKL à partir d'ARNm pré-épissé, interaction qui est augmentée pendant le traitement avec l'inhibiteur d'élongation de traduction Cycloheximide. Ces données soutiennent la notion que les peptides antigéniques sont dérivés de la traduction des ARNm pré épissés.

A key component of the immune systems' capacity to distinguish between self and non-self is the presentation of peptides on major histocompatibility complex class I (MHC-I) molecules. Non-self-peptides derived from pathogens or mutated self-proteins are recognized by cytotoxic CD8+ T cells leading to the destruction of the presenting cell. The presentation of intron-derived peptides on MHC-I molecules has raised the question of the origin of antigenic peptides for the MHC-I pathway. A better understanding of the origin of neo-antigens will lead to a better comprehension of viral and cancer immune evasion. For my Ph.D. study, I have focused on two different sources of antigenic peptides. Firstly, autophagy as a protein degradative mechanism, and secondly, pioneer translation products derived from pre-spliced mRNA. 1) Autophagy has an essential role in cellular homeostasis and can help rid the cells of harmful protein aggregates accumulation that can cause several diseases such as neurodegenerative disorders. Immune response towards cells carrying protein aggregates is relatively unknown and there is limited evidence for autophagy processing of antigenic peptides for the MHC class I pathway. To assess MHC-I antigen presentation of autophagy-derived antigenic peptides, we used CD8+ T cells (OT-1) that specifically recognize the chicken ovalbumin (OVA) SL8 epitope (SIINFEKL) presented on the murine Kb MHC-I molecules. We evaluated potential substrates for autophagy processing by the ovalbumin-SIINFEKL sequence fusion to the aggregate-prone polyglutamine (PolyQ) and the Epstein Barr Virus-encoded EBNA1 sequences. Suppressing autophagy by knocking down Atg5 and Atg12 did not affect the presentation of peptides derived from the EBNA1 protein, whereas it reduced the presentation of antigenic peptides derived from OVA, or OVA fused to the aggregate-prone PolyQ sequence. Surprisingly, fusing ovalbumin to the immune-evasive glycine-alanine repeat (GAr) of EBNA1 (GAr-OVA) prevented the presentation of peptides from OVA. These data suggest a substrate-dependent presentation of antigenic peptides for the MHC class I pathway via autophagy and illustrate a novel virus-mediated mechanism for immune evasion of autophagy-dependent antigen presentation. 2) Over time, the assumption that antigenic peptides are solely derived from the degradation of "old" full-length proteins has been replaced with the postulation that antigenic peptides are also derived from newly synthesized peptides by a specific non-canonical alternative translation event that occurs before mRNA splicing. This would explain the presence of intron-derived peptides on MHC-I molecules. In support of this, we observed that expressing the SIINFEKL sequence in the second intron of the β-globin gene triggered OT-1 CD8+ T cell proliferation. Using the proximity ligation assay (PLA), we observed an increase in SIINFEKL peptides from pre-spliced mRNAs following treatment with the Isoginkgetin splicing inhibitor and an MG-132 proteasome inhibitor. To start the characterization of this alternative translation complex, we used polysome fractionation to identify ribosomes on pre-spliced mRNAs. The pre-spliced beta-Globin mRNA is found on light polysomes, as opposed to the spliced beta-Globin mRNA that is present in the heavy polysomal fractions. We also observed with PLA, the interaction between ribosomal protein L5 (RPL5) with FEKL peptide sequence from pre-spliced mRNAs, which increased upon Cycloheximide translation elongation inhibitor. The data further supports the notion that antigenic peptides are derived from the translation of pre-spliced mRNAs.