Etude des mécanismes de l’oncogenèse épithéliale mammaire lors de l’infection par le cytomégalovirus et mise au point d’un vaccin.

Study of oncogenesis mechanisms of mammary epithelial cells during cytomegalovirus infection and the development of a vaccine.

• Auteur / Autrice : Sandy Haidar Ahmad
• Direction : Georges Herbein, Mona Diab-Assaf
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Médecine, cancérologie, génétique, hématologie, immunologie
• Date : Soutenance le 18/03/2022
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Agents pathogènes et inflammation (API) (Besançon)
• Partenaire(s) de recherche : Site de préparation : Université de Franche-Comté (1971-....)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Adotevi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Georges Herbein, Mona Diab-Assaf, Olivier Adotevi, Carine Van Lint, Christian Schwartz, Antoine Carpentier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Carine Van Lint, Christian Schwartz

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules épithéliales

Vaccins contre le cytomégalovirus

Cancérogenèse

Cancer du sein

Cytomégalovirus humain

Mots clés libres

Hcmv

Cancer du sein

Oncogenèse

Mécanismes moléculaires

Vaccin anti-CMV

Breast cancer

Oncogenesis

Molecular mechanisms

Anti-CMV vaccine

Résumé

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes. Il est reconnu comme l’une des principales causes de décès chez celles-ci. Le cytomégalovirus humain (HCMV) a été détecté dans 90 % des cancers du sein précoces et métastatiques. Les différences de capacité oncogène nous ont permis de classer les souches de HCMV en souches oncogènes à risque élevé ou faible. Par conséquent, nous avons comparé le profil du transcriptome des cellules épithéliales mammaires humaines (HMEC) infectées par la souche HCMV-BL à haut risque aux souches HCMV-TB40/E, FS, KM et SC à faible risque. Le transcriptome des HMEC infectés par une souche à haut risque présente des caractères oncogènes, favorise le cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). En accord avec ces profils de transcriptomes distincts, nous avons observé des capacités de transformation dans les HMEC infectés par la souche à haut risque BL mais pas lors de l'infection par les souches à faible risque. Ainsi, le transcriptome des HMEC infectés par des isolats cliniques du HCMV présente un « gradient oncogène » entre souches à faible et à haut risque de transformation. Les souches à haut risque induisent spécifiquement un environnement pro-oncogène qui pourrait participer au développement du cancer du sein. Pour définir le rôle du HCMV dans la transformation des HMEC infectés et déterminer son potentiel oncogène, nous avons étudié la présence de gènes et de protéines virales dans les cellules CTH (cellules HMECs transformées par la souche à haut-risque HCMV-DB). Comme nous avions précédemment détecté le gène HCMV lncRNA4.9 dans les cellules CTH, nous avons décidé d’évaluer la présence du gène UL69 situé à proximité immédiate du gène lncRNA4.9, et qui pourrait jouer un rôle dans la transformation des cellules CTH. Le gène UL69 qui a été détecté dans les cellules CTH a une séquence identique à 99% à celle du gène UL69 pr ésent dans le génome de la souche HCMV-DB. Au niveau protéomique, la séquence pUL69 présente dans les cellules CTH ne diffère de la protéine pUL69 HCMV-DB originale que par deux mutations ponctuelles d’acides aminés. De plus, pour étudier l’impact de la protéine pUL69 sur la réplication du HCMV et la prolifération des cellules CTH, l’expression du gène UL69 a été inhibée avec des siRNA. In vivo, le gène UL69 a été détecté avec une fréquence élevée dans les biopsies de cancer du sein. Nos résultats indiquent que le HCMV pourrait induire une transformation des cellules épithéliales mammaires par l’expression de gènes viraux, y compris le gène UL69. La présence du gène UL69 dans la majorité des biopsies isolées chez des femmes atteintes d’un cancer du sein indique l’importance potentielle du gène UL69 dans le développement de ce cancer. Après la détection des gènes et des protéines UL69 et UL70 dans les cellules CTH, nous avons évalué l’immunogénicité des peptides dérivés pUL69 et pUL 70 in vitro et in vivo. Vingt-huit peptides UL69 et UL70 ont été sélectionnés à l’aide d’une méthode d’algorithme prédictif et ont été évalués pour leur immunogénicité chez des donneurs sains et des patientes atteintes de cancer de sein (in vitro) et chez les souris transgéniques (in vivo). Certains épitopes ont induit des réponses immunitaires chez les donneurs sains et les patientes atteintes d’un cancer du sein. Par la suite, l’immunisation par l’ADN de souris transgéniques a provoqué de fortes réponses des lymphocytes T in vivo, ce qui indique que ces épitopes pourraient être utilisés comme immunogènes potentiels pour le développement d'un vaccin contre le HCMV. Notre étude est toujours en cours pour confirmer le meilleur candidat épitope pour le développement d’un vaccin peptidique contre le HCMV.

Breast cancer is the most common cancer diagnosed among women and is recognized as one of the main causes of death in women. Human cytomegalovirus (HCMV), a ubiquitous pathogen belonging to the Herpesviridae family, has been detected in 90% of early and metastatic breast cancers. HCMV causes asymptomatic to mild infection in immunocompetent host, but it can lead to serious complications in the immunocompromised host and cancer patients. The different oncogenic abilities allowed us to classify HCMV strains into high or low-risk oncogenic strains. Therefore, we compared the transcriptome profile of human mammary epithelial cells (HMECs) infected with the high-risk HCMV-BL strain versus the low-risk HCMV-TB40/E, FS, KM and SC strains. The transcriptome of HMECs infected with high-risk strain presents oncogenic traits, favors cell cycling, cell proliferation, and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). In agreement with these distinct transcriptome profiles observed, we noticed the highest transformation capacities in HMECs infected with the high-risk strain, but not with the low-risk ones. In line with the transcriptome phenotype observed in acutely infected HMECs, we perceived the preferential detection of high-risk HCMV strains along with the high expression of Ki67 in breast cancer biopsies, especially in the basal-like ones. Altogether, the transcriptome of HMECs infected with HCMV clinical isolates displays an “oncogenic gradient” where high-risk strains specifically induce a prooncogenic environment that might participate in breast cancer development. We previously identified the capacity of the clinical isolates HCMV-DB (KT959235) to promote oncogenic molecular pathways in primary human mammary epithelial cells, contribute to the formation of transformed cells named CMV-transformed HMECs -cells (CTH cells) in vitro, and produce tumorigenicity in mice models. To define the role of HCMV in the transformation of infected HMECs and to determine its oncogenic potential, we studied the presence of HCMV genes and proteins in CTH cells, even at low levels. Since we previously detected a long non-coding lncRNA4.9 gene in CTH cells, we decided to assess the presence of coding genes such as UL69 located nearby and downstream of the lncRNA4.9 gene, which might play a role in the transformation of CTH cells. The detected UL69 gene in CTH cells matched by 99% the UL69 gene sequence present in the HCMV-DB genome. At the proteomic level, the pUL69 sequence present in CTH cells differs from the original HCMV-DB pUL69 only in two amino acid point mutations. Furthermore, to reveal the impact of pUL69 on HCMV replication and CTH cell proliferation, UL69 gene expression was knocked down with siRNA. In-vivo, the UL69 gene was detected with high frequency in breast cancer biopsies. Our findings indicate that HCMV could induce transformation through viral gene expression, including the UL69 gene. The presence of the UL69 gene in the majority of biopsies isolated from women with breast cancer indicates the potential importance of the UL69 gene in breast cancer development. After the detection of UL69 and UL70 genes and proteins in CTH cells, we evaluated the immunogenicity of UL69 and UL70 derived peptides in vitro and in vivo. Twenty-eight pUL69 and pUL70 peptides were selected by using the predictive algorithm method and were evaluated for their immunogenicity in healthy donors and breast cancer patients (in vitro) and transgenic mice (in vivo). Few epitopes induced T-cell responses in healthy donors and breast cancer patients. Subsequently, DNA immunization of humanized transgenic mice elicited strong T-cell responses in vivo, indicating that these epitopes could be used as potential immunogens for the HCMV vaccine. Our study is still in progress and more experiments are needed to confirm the best epitope candidate for the development of the HCMV peptide vaccine.