Étude de nouvelles cibles pour le diagnostic de la trypanosomose animale africaine : Expression et purification d’antigènes recombinants de trypanosomes et évaluation de leur potentiel diagnostique Identification des antigènes immunoréactifs sécrétés par T. congolense

Study of new diagnostic targets for African animal trypanosomosis

• Auteur / Autrice : Magamba Tounkara
• Direction : Loïc Rivière, Adrien Belem
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie - immunologie
• Date : Soutenance le 05/07/2021
• Etablissement(s) : Bordeaux en cotutelle avec Institut des sciences exactes et appliquées (Bobo-Dioulasso, Burkina Faso)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie fondamentale et pathogénicité (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Nicolas Larmonier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Loïc Rivière, Adrien Belem, Nicolas Larmonier, Veerle Lejon, Brice Rotureau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Veerle Lejon, Brice Rotureau

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéomique

Antigènes parasitaires

Protéines recombinées

Diagnostic immunologique

Trypanosomiase -- Chez les animaux

Trypanosoma

Mots clés libres

Trypanosomose animale africaine

Trypanosomes

Serodiagnostic

Protéines recombinantes

Combinaison d'antigènes

Protéomique

African animal trypanosomosis

Trypanosomes

Serodiagnosis

Recombinantes proteins

Antigens combination

Proteomic

Résumé

Trypanosoma congolense, T. vivax et T. brucei brucei sont les agents responsables d’une maladie dévastatrice du bétail, appelée trypanosomose animale africaine (TAA) ou nagana, qui touche 38 pays africains de la région subsaharienne. En absence du vaccin, le contrôle de la maladie repose sur la lutte anti-vectorielle, la chimiothérapie et le diagnostic, une étape indispensable à la mise en place des traitements appropriés et au suivi. Le diagnostic sérologique, bien qu’applicable sur le terrain selon le format du test, rencontre toutefois des limitations. Il manque de standardisation des antigènes, de sensibilité et de spécificité avec des tests de diagnostic rapide (TDR) souvent peu accessibles. Les objectifs de cette thèse étaient de : (i) caractériser le potentiel diagnostique de protéines identifiées et étudiées dans les laboratoires d’accueils, (ii) sélectionner à partir des données « omiques », de nouvelles cibles et évaluer leur potentiel diagnostique individuel et en combinaison, et (iii) identifier les protéines immunogéniques à partir d’analyse protéomique et immuno-informatique du sécrétome de trypanosomes. L’exploration du potentiel diagnostique de protéines candidates a été réalisée, après leur expression et leur purification, par ELISA indirect avec des sérums de bovins issus d’infections expérimentales et des sérums issus de bovins infectés naturellement par les trypanosomes. Testées individuellement, les protéines ont montré une faible sensibilité. Cependant, la combinaison des protéines d’immuno-réactivité équivalente a permis d’augmenter significativement la sensibilité des tests avec une spécificité qui reste satisfaisante. Ces résultats constituent une preuve de concept, de la performance des combinaisons de protéines dans le diagnostic de la TAA. Il offre la possibilité d’explorer de nouvelles approches innovantes, notamment l’association de peptides immunogéniques de différentes protéines immunoréactives sous forme de chimères pour le diagnostic sérologique. D’autre part, et au regard de leur performance, aucune des protéines nouvellement testées ne pourra être incluse de manière individuelle dans un TDR. Pour trouver des candidats adaptés, nous avons identifié des protéines sécrétées/excrétées de trypanosomes par spectrométrie de masse. Grâce à une analyse de prédiction d’épitopes, nous avons identifié une centaine de protéines putativement immunogéniques présentant plusieurs épitopes dans leurs séquences. L’analyse de la réactivité des sérums provenant de différentes races bovines avec le sécrétome de trypanosomes a permis de détecter des protéines fortement reconnues par les anticorps des sérums utilisés et correspondant principalement à quatre tailles moléculaires. À ces tailles, un grand nombre de protéines caractérisées in silico comme immunogéniques avaient été détectées. Ces données fournissent une base de sélection fiable des nouvelles protéines à inclure dans les tests sérologiques de la TAA. Elles permettent également de mieux comprendre les différences de réponses humorales de races bovines présentant une susceptibilité différente aux trypanosomoses.

Trypanosoma congolense, T. vivax, and T. brucei brucei are the causative agents of a devastating disease of livestock, known as African animal trypanosomiasis (AAT) or nagana, occurring in 38 African countries in the sub-Saharan region. Without a vaccine, the control of the disease relies on vector control, chemotherapy, and diagnosis, which is essential for appropriate treatment and follow-up. Serological diagnosis, although applicable in the field according to the test format, has limitations. It lacks antigen standardization, sensitivity and specificity, with rapid diagnostic tests (RDTs) being often inaccessible. The aims of this thesis were to: (i) characterize the diagnostic potential of proteins identified and studied in the host laboratories, (ii) select, from "omics" data, new targets and evaluate their diagnostic potential individually and in combination, and, (iii) identify immunogenic proteins from proteomic and immunoinformatic analysis of the trypanosome secretome. Diagnostic potential of candidate proteins was explored, after their expression and purification, by indirect ELISA with bovine sera from experimental infections and sera from cattle naturally infected by trypanosomes. Individually, the proteins showed low sensitivity. However, combining proteins of equivalent immunoreactivity significantly increased the sensitivity of the tests with a specificity that remained satisfactory. These results constitute a proof of concept of the performance of protein combinations in the diagnosis of AAT. It provides an opportunity to explore new innovative approaches, including the combination of immunogenic peptides of different immunoreactive proteins in the form of chimeras for serological diagnosis. Furthermore, and in consideration of their performance, none of the newly tested proteins could be included individually in an RDT. To find appropriate candidates, we identified trypanosome secreted/excreted proteins by mass spectrometry. Using epitope prediction analysis, we identified approximately 100 putatively immunogenic proteins with multiple epitopes in their sequences. The reactivity analysis of sera from different bovine breeds with the trypanosome secretome showed that the proteins were strongly recognized by the antibodies of the sera used and corresponded mainly to four molecular sizes. At these sizes, a significant number of proteins characterized in silico as immunogenic were detected. These results provide a reliable data for selection of new proteins to be include in serological tests for AAT. They also provide a better understanding of the differences in humoral responses of cattle breeds with different susceptibility to trypanosomosis.