Caractérisation structurale protéomique et fonctionnelle d'endosulfatases humaines Hsulfs modulant la sulfatation de l'héparane sulfate et biomarqueur de progression tumorale

par Mélanie Bilong

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Régis Daniel et de Florence Gonnet.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....) , en partenariat avec Laboratoire analyse et modélisation pour la biologie et l'environnement (laboratoire) et de Université d'Évry-Val-d'Essonne (établissement de préparation de la thèse) depuis le 30-09-2018 .


  • Résumé

    Les héparanes sulfates (HS) sont des polysaccharides complexes présents en abondance à la surface des cellules et dans les matrices extracellulaires. Ils sont capables de fixer un grand nombre de ligands dont ils modulent ensuite l'activité biologique. Ces propriétés d'interaction des HS, cruciales pour la cellule, dépendent du profil de sulfatation du polysaccharide. La distribution des groupements sulfate le long de la chaîne est finement régulée d'une part au cours de la biosynthèse du polysaccharide, et d'autre part à la surface cellulaire par l'action d'enzymes uniques récemment identifiées, les endosulfatases nommées Sulfs. Ces enzymes ôtent spécifiquement les groupements 6-O-sulfate d'un certain nombre de disaccharides trisulfatés, unités constitutives du polysaccharide et éléments clés de nombreuses interactions protéines/HS. De par leur rôle, ces enzymes sont impliquées dans de nombreux processus, autant physiologiques que pathologiques. Beaucoup d'études ont mis en exergue l'implication des Sulfs dans le développement embryonnaire, la régénération tissulaire ou le cancer, et en particulier dans les mécanismes qui régissent l'angiogenèse tumorale. Dans ce contexte, le projet vise à étudier les formes humaines de ces enzymes HSulf-1 et -2, afin d'élucider leur organisation structurale et de clarifier leur mode d'action avec à terme le développement d'inhibiteurs originaux et sélectifs dans un but d'action thérapeutique. Les endosulfatases humaines HSulf-1 et HSulf-2 (EC : 3.1.6.- ; sulfo-esterase) sont des hydrolases clivant les liaisons sulfo-esters. Elles présentent une activité aryl-sulfatase qui s'exerce sur les glucosamines-6-O-sulfate, et catalysent ainsi la 6-O-désulfatation du glycosaminoglycane héparane sulfate présent à la surface cellulaire. Pour cela, la cellule secrète ces enzymes dans l'environnement extra-cellulaire où elles se localisent à la surface cellulaire et dans la matrice extracellulaire. La 6-O-désulfatation de HS catalysée par les HSulfs est relativement limitée. Cependant, en agissant spécifiquement sur les groupements 6-O-sulfate des zones très sulfatées de l'HS (domaines NS), ces enzymes modifient significativement la capacité du polysaccharide à interagir avec un grand nombre de ses ligands, et jouent ainsi un rôle important dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. A ce jour, l'organisation structurale de HSulf-1 et HSulf-2 demeure mal connue. Ces enzymes sont synthétisées sous forme d'une protéine qui devient mature après clivage par la furine. Ces deux isoformes présentent une organisation moléculaire commune constituée de deux chaînes reliées vraisemblablement par des ponts disulfures. Outre le domaine catalytique porté par l'une des chaînes, un domaine hydrophile (HD) débordant sur les deux chaînes et unique à ces endosulfatases constitue une structure de reconnaissance du substrat : l'organisation de cette structure résultant d'un repliement des deux chaînes reste à déterminer. Les objectifs de ce travail visent à la fois à caractériser la structure, et à élucider les propriétés d'interaction et d'activité catalytique de HSulf-1 et HSulf-2, par une étude intégrée de ces deux isoformes humaines, combinant des approches biochimiques, de protéomique basées entre autres sur la spectrométrie de masse et biophysiques en vue de déterminer leur structure et leurs modifications post-traductionnelles, ainsi que des analyses fonctionnelles in vitro, et in cellulo. Nous avons déterminé dans nos récents travaux la séquence de HSulf-2 par des approches de type protéomique top-down et bottom-up. Une attention particulière est portée à la détermination des modifications post-traductionnelles (ponts disulfures, glycosylations, etc.) à l'aide de marquages chimiques différentiels et l'utilisation de la dissociation par transfert d'électrons (ETD). L'organisation structurale sera également étudiée par marquage oxydatif combiné à la spectrométrie de masse. L'ensemble des données obtenues permettra d'identifier les différents domaines fonctionnels des HSulfs humaines, de comprendre l'organisation conformationnelle contribuant au domaine de reconnaissance des chaînes d'HS, et d'établir les bases moléculaires de la reconnaissance HSulfs/HS. Les résultats obtenus devraient fournir des informations précieuses sur cet important mécanisme de régulation de l'activité des HS. Par ailleurs, ils devraient établir les bases structurales pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les HSulfs, notamment par la conception d'inhibiteurs spécifiques basés sur des mimétiques d'HS (projet ANR).

  • Titre traduit

    Proteomic structural and functional characterization of human endosulfatases HSulfs, key enzymes involved in the modulation of the sulfation pattern of heparan sulfate and biomarkers of tumor progression


  • Résumé

    The human enzymes HSulf-1 and HSulf-2 are two extracellular 6-O-endosulfatase recently discovered. They specifically remove 6-O sulfate group in heparan sulfate (HS), a glycosaminoglycan (GAG) located on cell surface and in the extracellular matrix. It is assumed that HS sulfation pattern may host an informational content governing the recognition and the interaction of HS with various protein ligands (cytokines, growth factors, etc.). By varying the HS sulfation pattern, HSulf-1 and HSulf-2 modulate HS-ligand interactions, and consequently they are involved in many physio-pathological processes. Sulfs are extracellular sulfatases that have emerged recently as critical regulators of heparan sulfate (HS) activities through their ability to catalyze specific 6-O- desulfation of the polysaccharide. Consequently, Sulfs have been involved in many physiological and pathological processes, and notably for Sulf-2, in the development of cancers with poor prognosis. Despite growing interest, little is known about the structure and activity of these enzymes and the way they induce dynamic remodeling of HS 6-O- sulfation status. To date, the structural organization of HSulfs remains elusive. Some pieces of information revealed that both HSulf isoforms have a common molecular organization: their maturation into active form requires a cleavage by furin, yielding two chains presumably linked by disulfide bonds that are absolutely essential for activity. The goals of this work are to achieve the fine structural and functional characterization of HSulf enzymes and elucidate their properties of interaction with GAGs, using mass spectrometry-based complementary proteomic approaches. Based on these data, the doctoral project proposes to deliver an integrated study of the human isoforms HSulf-1 and HSulf-2, combining biochemical and biophysical approaches to characterize their structure and post-translational modifications ; in vitro, in cellulo and in vivo functional analysis to determine their substrate specificities and respective role during tumour progression ; and the development of specific inhibitors based on HS mimetics. This project should provide major insights into the regulatory role played by these enzymes in many biological processes and deliver the structural basis for the development of therapeutic strategies targeting HSulfs.