Rôle des multicopper oxydases (MCO) dans l'homéostasie du fer chez Arabidopsis thaliana

par Alexis Brun

Projet de thèse en Biologie du développement

Sous la direction de Stéphane Mari.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau , en partenariat avec BPMP - Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes (laboratoire) depuis le 01-10-2018 .


  • Résumé

    Contexte Chez les plantes, l'étude de l'homéostasie du fer (Fe) a principalement été abordée sous le prisme du prélèvement depuis le sol, là où le fer, majoritairement sous la forme ferrique Fe3+, est le plus limitant. Ceci explique l'importance qui a été donnée à la régulation des systèmes de réduction ferrique, au détriment des systèmes d'oxydation. Le fer impose aux cellules, animales ou végétales, un vrai « casse-tête » : le Fe3+ est chimiquement presque inerte, peu soluble et peu réactif, alors que le Fe2+ est très soluble, métaboliquement actif, mais également très pro-oxydant donc potentiellement très toxique. Le casse-tête est résolu, chez les cellules animales, par un cycle redox impliquant des activités réductase ferrique et ferroxydase. Chez les mammifères, la ferroxydase (hephaestine, Hp) est associée au plasmalemme, avec un site catalytique situé du côté extracellulaire. Couplée à un transporteur d'efflux de Fe2+ (ferroportine), l'hephaestine catalyse l'oxydation du Fe2+ en Fe3+ permettant son incorporation à la transferrine, qui va circuler dans le corps et délivrer le fer aux différents organes. Chez la levure, l'activité ferroxydase, codée par Fet3, fait partie de la machinerie d'absorption du fer à haute affinité, qui est composée d'une réductase, Fre1, qui va mobiliser le fer du milieu en générant du Fe2+ plus mobile, de Fet3 qui ré-oxyde le fer pour le délivrer à la perméase ferrique Ftr1. Les protéines Fet3 et Hp ont des caractéristiques structurales communes : un domaine d'encrage à la membrane et un domaine multicopper oxidase (MCO) contenant plusieurs atomes de cuivre. Chez la levure, l'implication des MCO dans le cycle redox du fer a mis en évidence la connexion étroite entre l'homéostasie du fer et celle du cuivre : pour être active, la protéine FET3 nécessite des atomes de cuivre. Le Cu est incorporé à FET3 dans des vésicules intracellulaires par un système de transport complexe impliquant les transporteurs plasmalemmiques (CTR1 et CTR3), une chaperone à Cu (Atx1) et Cu-ATPase (Ccc2). Toute mutation de cette machinerie entraîne, in fine, une sensibilité à la carence en fer. Chez Arabidopsis thaliana, il est possible d'identifier, au sein de la grande famille des laccases, une sous-famille de trois protéines annotées comme multi copper oxidases (AtMCO1, AtMCO2 et AtMCO3). Ces protéines ont une structure prédite comparable à la protéine Fet3 de levure, avec un domaine transmembranaire en N-terminal et un domaine multicopper oxidase, vraisemblablement exposé du côté extra-cellulaire. Ces protéines n'ont pas de rôle connu pour l'instant. Projet Nous proposons d'étudier la fonction des gènes codant pour les MCO vis-à-vis de l'homéostasie du fer. Pour cela, une approche classique de physiologie moléculaire sera développée, où l'on étudiera le profil d'expression de ces gènes ainsi que la régulation de l'expression par le statut nutritionnel en fer (RT-QPCR et lignées transgéniques promoteur-GUS), la localisation subcellulaire (immunofluorescence avec anticorps anti-MCO3), le phénotype des mutants knock-out (simples et double mutants) en conditions combinées de carence et d'excès de fer et de cuivre ainsi que la localisation du fer dans les tissus (WT et mutants) par histochimie avec la technique du Perls/DAB, développée dans l'équipe.

  • Titre traduit

    Role of multicopper oxidases (MCO) in iron homeostasis in Arabidopsis thaliana


  • Résumé

    Context In plants, iron (Fe) homeostasis research has been mainly focused on the uptake from soil, where iron, mostly present under its ferric form, is more limiting. Therefore, most of the efforts were devoted to identify the ferric reduction machinery that will regulate Fe acquisition by plants, in detriment of oxidation systems. Iron imposes to all living cells a real conundrum: Fe3+ is chemically almost inert, poorly soluble and reactive, whereas Fe2+ is highly soluble, metabolically active but also extremely pro-oxidant, thus potentially very toxic. This conundrum is solved, in animal cells, by a redox cycle that involves ferric reductases as well as ferroxidases. In mammalian cells, the ferroxidase (hephaestin, Hp) is associated to the plasma membrane with an extracellular catalytic site. Coupled to a Fe2+ efflux transporter (ferroportin), hephaestin catalyses the ferroxidation of Fe2+, allowing its binding as Fe3+ to transferrin, that circulates in the whole body to deliver Fe. In yeast, the ferroxidase activity, encoded by Fet3, is part of the high affinity Fe uptake system, composed of a ferric reductase (Fre1) that remobilizes ferric iron from the medium and generating the more mobile Fe2+, Fet3 that re-oxidizes Fe2+ to deliver it to the ferric permease Ftr1. Hephaestin and Fet3 have some common structural features: a transmembrane anchoring domain and a multicopper oxidase (MCO) domain containing several copper atoms. In the Arabidopsis genome, it is possible to identify three genes coding for peptides annotated as “multicopper oxidases”, with the same predicted structural features: a N-terminal transmembrane domain and a multicopper oxidase domain, likely exposed towards the extracellular side. Project The aim of the project is to study the function of these three genes, in the context of Fe homeostasis in the model plant Arabidopsis thaliana. A classical molecular physiology approach will be developed, where we will study the expression profile of the genes and their regulation by the Fe nutritional status (RT-QPCR and transgenic lines expressing promoter-GUS fusions), the subcellular localization of the proteins (RFP fusions and immune fluorescence), the phenotype of the corresponding knock out mutants in conditions of Fe excess and deficiency, the imaging of Fe in tissues and cells by the Perls/DAB technique developed in the team.