Ingénierie et caractérisation des canaux Kir et des récepteurs-canaux bactériens

Engineering and characterization of Kir channels and bacterial ligand-gated ion channels

• Auteur / Autrice : Mathilde Folacci
• Direction : Michel Vivaudou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 25/03/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Donald Martin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michel Vivaudou, Guillaume Sandoz, Laetitia Mony, Pierre Charnet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anna Moroni, Thomas Grutter

Mots clés

Mots clés contrôlés

Électrophysiologie

Canaux ioniques

Optogénétique

Mots clés libres

Optogénétique

Canaux ioniques

Electrophysiologie

Ion channel

Optogenetics

Electrophysiology

Résumé

Les canaux potassiques rectifiants entrants (Kir) sont exprimés dans divers types cellulaires. Ils contrôlent l'excitabilité cellulaire et le potentiel membranaire. Sept sous-familles de canaux Kir sont connues, de Kir1 à Kir7. Dans cette étude, l'intérêt est porté sur les canaux Kir2, Kir3 (aussi appelés canaux GIRK), et Kir6.Trois projets ont été menés et sont présentés ici :1) Ingénierie de canaux Kir sensibles à la lumièreLe projet principal consistait à concevoir des canaux Kir sensibles à la lumière, avec pour objectif de fournir des outils pour contrôler l'excitabilité cellulaire et de déchiffrer le rôle physiologique de ces canaux dans divers tissus.Pour rendre ces canaux sensibles à la lumière, l'approche "PTL" (Photosensitive Tethered Ligand) a été utilisée. Cette dernière est basée sur l'attache d'un modulateur à une cystéine introduite dans le canal.Des tests fonctionnels ont été réalisés en exprimant les canaux dans des ovocytes de Xénopes et dans des cellules de mammifères, ainsi qu'en analysant leur réponse à la lumière à l'aide des techniques de Patch-Clamp et de double microélectrode.De nouveaux canaux Kir2.1, Kir3.2, Kir3.4 et Kir6.2 ont été obtenus et sont présentés ici.2) Étude de récepteurs-canaux bactériensLes récepteurs-canaux procaryotes de différents organismes ont été étudiés (ELIC, de Erwinia Chrysanthemi; ViLIC de Vibrio nigripulchritudo; FlaLIC, de Flavobacterium johnsoniae). ViLIC et FlaLIC sont peu étudiés et le manque de modulateurs connus rend leur étude problématique.Ces récepteurs-canaux bactériens n'ayant jamais été exprimés dans l'ovocyte de Xénope, pour confirmer leur présence à la surface de la cellule, une technique de luminescence, utilisée dans des cellules de mammifères, a été employée pour la première fois dans l'ovocyte de Xénope. Nous avons adapté avec succès cette méthode à notre système d'expression et montré que seulement ELIC et FlaLIC étaient présents à la membrane plasmique. Différents ligands potentiels ont ensuite été testés utilisant la technique de double microélectrode, ceci menant à la découverte de nouveaux agonistes pour ELIC et FlaLIC.La technique de luminescence dans l'ovocyte de Xénope a aussi été appliquée aux canaux Kir6, permettant ainsi de vastes perspectives pour l'étude de la physiopathologie de ces protéines.3) Caractérisation électrophysiologique des canaux Kir2.1 mutés responsables de troubles cardiaquesLa CPVT (Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia) est un syndrome d’arythmie sévère avec un risque élevé de mort subite chez l'enfant lorsqu'elle n'est pas traitée. Les conséquences fonctionnelles de deux mutations, une nouvelle (P186Q) et une précédemment décrite (R82W), dans le gène KCNJ2, identifiées chez des patients avec un phénotype similaire à la CPVT ont été caractérisées. L'effet fonctionnel de ces mutations a été testé en utilisant la technique de double microélectrode dans l'ovocyte de Xénope.Nous avons observé une réduction drastique de l'activité des canaux mutés homomériques, et une variation de ces effets dans les canaux hétéromériques, en fonction du ratio de sous-unités Kir2.1 sauvages ou mutées.

Inward-rectifying potassium (Kir) channels are expressed in various cell types. They control cell excitability and resting membrane potential. Seven Kir subfamilies are known, from Kir1 to Kir7. In this work we focus on Kir2, Kir3 (also called GIRK for G-protein gated Inward rectifying potassium) and Kir6 (forming KATP channels in association with sulfonylurea receptors) channels. Three projects were carried out and are presented:1) Design of light-sensitive Kir channelsThe main project was to design light-sensitive Kir channels as tools for controlling cell excitability and deciphering the physiological roles of these channels in various tissues.To confer light-sensitivity to Kir channels, the photoswitched tethered ligand (PTL) approach was used, based on the grafting of a light-sensitive blocker to a cysteine residue introduced in the channel.Functional tests were performed by expressing channels in Xenopus laevis oocytes and in mammalian cells and analyzing their response to light using patch-clamp and Two-Electrode Voltage Clamp (TEVC) techniques.New light-modulated Kir2.1, Kir3.2, Kir3.4 and Kir6.2 channels were achieved and are presented here.2) Study of bacterial ligand-gated ion channelsProkaryotic ligand-gated ion channels (LGIC) from Erwinia Chrysanthemi (ELIC), Vibrio nigripulchritudo (ViLIC) and Flavobacterium johnsoniae (FlaLIC) were investigated. ViLIC and FlaLIC are poorly studied and the lack of known modulators render their study problematic. To confirm their presence at the cell surface, a luminescence technique, used in mammalian cells, was employed for the first time in Xenopus laevis oocytes. We successfully adapted this method to our expression system and showed that only ELIC and FlaLIC were present in the plasma membrane. Different potential ligands were tested using TEVC leading to the discovery of new agonists for ELIC and FlaLIC.The luminescence method was also applied to Kir6 channels allowing broad perspectives to investigate the physiopathological functions of these proteins.3) Electrophysiological characterization of mutated Kir2.1 channels causing cardiac disordersCatecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia (CPVT) is a severe arrhythmia syndrome, with a high risk of sudden death in late infancy when untreated. Functional consequences of a novel (P186Q) and a previously described (R82W) KCNJ2 mutations, identified in patients with CPVT-like phenotypes were characterized.Functional effects of these mutations were tested by TEVC in Xenopus laevis oocytes. We observed a drastic reduction of the homomeric mutated channels’ activity, and a variation of this effect in heteromeric channels depending on the subunits ratio of wild type or mutated Kir2.1 channels.