Etude structurale du transporteur ABC « Bacillus subtilis multidrug resistance ATP » et caractérisation de la couronne amphiphile des protéines membranaires

Structural study of the ABC transporter « Bacillus subtilis multidrug resistance ATP » and characterization of the amphipathic belt wrapping membrane proteins

• Auteur / Autrice : Veronica Zampieri
• Direction : Vincent Chaptal, Pierre Falson
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 18/12/2020
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....)
• Jury : Président / Présidente : Adriana-Erica Miele
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Vincent Chaptal, Pierre Falson, Martin Picard, Cécile Breyton, Mickaël Blaise, Isabelle Broutin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Martin Picard, Cécile Breyton, Mickaël Blaise

Mots clés

Mots clés contrôlés

Radiocristallographie

Protéines membranaires

Transporteurs ABC

Résistance aux antibiotiques

Mots clés libres

BmrA

Transporteur ABC

Cryo-EM

Structure protéique

Cristallographie aux rayons X

MDR

Substrat

BmrA

ABC transporter

Structure

Cryo-EM

X-ray cristallography

Substrate

MDR

Résumé

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), la résistance aux antibiotiques est devenue un des problèmes majeurs de la santé publique, surtout due à une utilisation incorrecte de ces molécules. Les bactéries peuvent adopter plusieurs mécanismes dont l’exportation de la molécule par des transporteurs membranaires. Les transporteurs ABC (ATP Binding Cassette) font partie des protéines responsables de ces processi ; elles utilisent l’ATP afin de garantir leur action. La protéine membranaire BmrA (Bacillus subtilis multidrug resistance ATP) est un transporteur ABC exprimé chez Bacillus subtilis qui est résistant à l’antibiotique Cervimycin C due à cette protéine membranaire. Elle possède aussi un phénotype MDR (multi-drug resistance) car elle peut transporter une large variété de molécules (doxorubicine, Hœchst 33342, etc.). Nous avons résolu la structure de BmrA par cristallographie et par Cryo-EM afin d’étudier son mécanisme. Les structures sont dans une conformation exposant la cavité vers l’extérieur (outward-facing conformation) et une d’entre-elles a le substrat, rhodamine 6G, fixé dans la région transmembranaire. L’analyse des structures de BmrA et celles d’autres transporteurs ABC met en évidence un mouvement en éventail de la région membranaire, que l’on a pu reproduire par des simulations de dynamique moléculaire. La flexibilité de cette région qui rémoigne de la plasticité des transporteurs ABC peut être responsable du relargage de la molécule. Par ailleurs, la biologie structurale des protéines membranaires est un domaine complexe dû à leur nature amphiphile. La présence d’autres molécules amphiphiles comme les détergents ou les lipides est donc requise pour maintenir en solution ce type de protéines. La couronne qui se forme autour de leur partie hydrophobe a été caractérisée expérimentalement (quantification des détergents liés et estimation de la taille), puis modélisée (développement du serveur Det.Belt) et les résultats transposés à l’analyse des données de Cryo-EM.

The antibiotic resistance is classified as a major human health threat by the World Health Organization (WHO) mainly due to a misuse of these compounds. Bacteria can adopt the different molecular mechanisms and one of them is the efflux of the compound outside of the cell. The ABC transporters are one of the membrane proteins families responsible for this action. Their name derives from the fact that they use the ATP to ensure its activity. The membrane protein BmrA (Bacillus subtilis multidrug resistance ATP) is an ABC transporter from Bacillus subtilis and it confers the resistance to the antibiotic Cervimycin C. In addition, it displays a multi-drug resistance phenotype (MDR) since it exports various compounds (doxorubicin, Hœchst 33342, etc.) varying in size and shape. Structures of BmrA have been solved using X-ray crystallography and single particle Cryo-EM, aiming at understanding the mechanism of drug export. One of the structures has a substrate bound, rhodamine 6G, and all of them are in outward-facing conformation. The analysis of these structures, and those of other ABC transporters shows a hand-fan movement of the transmembrane region that could be reproduced by molecular dynamic simulations. This movement, typical of the plasticity of these transporters, could be responsible for the release of drugs. Furthermore, the structural study of membrane proteins is complicated by their amphipathic nature. They require the presence of amphipathic molecules to stay in water solution. The amphipathic belt has been a constant focus during this project. It has been characterized experimentally by quantifying the amount of bound detergent together with the size and shape of the belt. Then, the Det.Belt server has been set up to dynamically draw this belt, depending on the detergents around. Finally, all this information has been used in the context of Cryo-EM to improve data analysis.