Contrôle optogénétique du potentiel de membrane et de l'homéostasie calcique dans le modèle musculaire squelettique : impact sur les processus myogéniques

Optogenetic control of membrane potential and calcium homeostasis in skeletal muscle cells : impact on myogenic processes

• Auteur / Autrice : Charles-Albert Chapotte-Baldacci
• Direction : Stéphane Sebille, Aurélien Chatelier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie et physiopathologie
• Date : Soutenance le 31/03/2021
• Etablissement(s) : Poitiers
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Biologiques et Santé (Limoges ; 2018-2022)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires (Poitiers ; 2014-2021)
• Partenaire(s) de recherche : faculte : Université de Poitiers. UFR des sciences fondamentales et appliquées
• Jury : Président / Présidente : Bruno Constantin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphane Sebille, Aurélien Chatelier, Christophe Vandier, Christian Pinset
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Gailly, Vincent Jacquemond

Mots clés

Mots clés contrôlés

Membranes excitables

Calcium

Myopathie pseudo-hypertrophique de Duchenne

Myogénèse

Optogénétique

Mots clés libres

Optogénétique

ChR2

ENpHR

Homéostasie calcique

Myogenèse

Dmd

Optogenetics

ChR2

ENpHR

Calcium homeostasis

Myogenesis

Dmd

Résumé

Le calcium est un second messager qui participe à de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la migration, la différenciation, l’apoptose et la transmission de messagers neuronaux. Dans le modèle musculaire squelettique, le calcium est un acteur important dans le processus du couplage excitation-contraction. Il est également impliqué dans la myogenèse et dans les processus de réparation. Une dérégulation du calcium dans les cellules musculaires participe à leur dégénérescence comme il a été observé dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif de cette thèse a été par des approches innovantes d’optogénétique, d’explorer et de moduler des mécanismes fondamentaux dépendants du calcium tels que la migration, la fusion, la différenciation et la contraction dans différents modèles musculaires. 1- Dans un premier temps, l’effet de la stimulation de l’halorhodopsine (eNpHR) sur le contrôle du potentiel de membrane et sur le processus de migration de myoblastes C2C12 a été étudié. La transfection de eNpHR3.0 dans des myoblastes C2C12 a permis de générer des courants sortants diminuant le potentiel de membrane vers des valeurs stabilisées tout le long de la stimulation. Cette polarisation membranaire induit des élévations transitoires de calcium cytosolique, dépendant du canal TRPV2 localisé à la membrane plasmique. Après avoir démontré l’implication de TRPV2 dans les processus migratoires des myoblastes, les entrées de calcium induites par la stimulation lumineuse ont permis d’augmenter la migration TRPV2-dépendante des myoblastes C2C12. 2- Dans un second temps, l’impact de la stimulation par le canal rhodopsine 2 (ChR2) a été évalué pour le contrôle de l’activité calcique et sur les processus de différenciation dans des cultures primaires de myotubes murins. Après avoir caractérisé la signature calcique des cultures primaires de myotubes en différenciation avec la protéine fluorescente sensible au calcium GCaMP, un protocole de simulation optique a été développé pour reproduire la signature calcique spontanée de myotubes différenciés. En premier lieu, le contrôle de l’activité calcique par la stimulation optique de ChR2 a été confirmé au niveau d’une cellule unique ainsi qu’à l’échelle d’une culture entière. Par la suite, l’application d’un protocole de stimulation optique en culture pendant la différenciation a permis de moduler les processus de différenciation tels que la fusion et la contraction des myotubes primaires. 3- La signature calcique de cellules dystrophiques représentatives de la DMD a été explorée dans deux modèles cellulaires différents composés de cultures primaires isolées de souris mdx et de cellules musculaires humaines dérivés d’hiPSCs provenant de patients DMD. Des dérégulations de la signature calcique ont été observées dans ces deux modèles dystrophiques. Une exploration fonctionnelle a été réalisée sur les cellules musculaires dérivées d’hiPSCs au travers de stimulations électriques, pharmacologiques et optiques démontrant leur capacité à développer un phénotype musculaire et confirmant leur intérêt potentiel pour la modélisation de maladies telles que la DMD.Ces travaux ouvrent des perspectives sur l’utilisation de l’optogénétique pour évaluer la fonctionnalité des cellules et pour moduler certains processus cellulaires pour de futures applications thérapeutiques.

Calcium is a second messenger which participates in many cellular processes such as proliferation, migration, differentiation, apoptosis and transmission of neuronal messengers. In skeletal muscle, calcium is an important player in the process of excitation-contraction coupling. It is also involved in myogenesis and in repair processes. Deregulation of calcium in muscle cells contributes to their degeneration as observed in Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). The objective of this thesis was to explore and modulate basic calcium-dependent mechanisms such as migration, fusion, differentiation and contraction in different muscle models through innovative optogenetic approaches. 1- First, the effect of halorhodopsin (eNpHR) stimulation on the control of membrane potential and on the migration process of C2C12 myoblasts was studied. Transfection of eNpHR3.0 into C2C12 myoblasts generated outward currents decreasing the membrane potential to stable values throughout stimulation. This membrane polarization induces cytosolic calcium transients, dependent on the TRPV2 channel located at the plasma membrane. After demonstrating the involvement of TRPV2 in the migratory process of myoblasts, the light-induced calcium constitutive entries allowed to increase the TRPV2-dependent migration of C2C12 myoblasts. 2- Secondly, the impact of channelrhodopsin 2 (ChR2) stimulation was evaluated for the control of calcium activity and on the differentiation processes in primary cultures of murine myotubes. We characterized the calcium signature of myotube primary cultures with the fluorescent calcium sensitive protein GCaMP. An optical simulation protocol was then developed to reproduce the spontaneous calcium signature of differentiated myotubes. To reach this goal, we first confirmed the control of calcium activity by optical stimulation of ChR2 at the single cell level as well as at the level of a whole culture. Finally, the application of an optical stimulation protocol in culture during differentiation allowed to modulate differentiation processes such as fusion and contraction of primary myotubes. 3- The calcium signature of dystrophic cells representative of DMD was explored in two different cell models: primary cultures isolated from mdx mice and human muscle cells derived from DMD hiPSCs. Changes in calcium signature was observed in these two dystrophic models. A functional exploration was performed on muscle cells derived from hiPSCs through electrical, pharmacological and optical stimulation demonstrating their ability to develop a muscle phenotype and confirming their potential interest in modeling diseases such as DMD.This work opens perspectives on the use of optogenetics to evaluate cell functionality and to modulate some cellular processes for future therapeutic applications.