Caractérisation structurale de nouvelles protéines fluorescentes de type GFP ou dérivées de phytochromes

Structural characterisation of novel GFP-like and phytochrome-derived fluorescent proteins

• Auteur / Autrice : Hadrien Depernet
• Direction : Antoine Royant, Gordon Leonard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 30/03/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European synchrotron radiation facility (Grenoble, Isère, France ; 1988-....) - Structural biology group (Grenoble, Isère, France ; 20..-....)
• Jury : Président / Présidente : Dominique Bourgeois
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Royant, Gerlind Sulzenbacher
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nushin Aghajari, Jean-Denis Pedelacq

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phytochrome

Protéine fluorescente verte

Spectroscopie infrarouge proche

Protéines fluorescentes

Mots clés libres

Biologie structurale

Protéines fluorescentes

Protéines fluorescentes proche infrarouge

Gfp

Phytochromes

Structural Biology

Fluorescent proteins

Near-Infrared fluorescent proteins

Gfp

Phytochromes

Résumé

Depuis le clonage de la protéine fluorescente verte (GFP) en 1992, les protéines fluorescentes (PF) sont progressivement devenues des outils essentiels de l'imagerie cellulaire. La GFP a été découverte chez la méduse Aequorea victoria, mais des homologues ont ensuite été trouvés dans d'autres types d'organismes tels que des coraux, des anémones de mer, des amphoxius (ou lancelets) et de petits crustacés, formant ainsi la famille des PF de type GFP. Une caractéristique unique des protéines de type GFP est la formation auto-catalytique du chromophore, la partie de la protéine qui absorbe la lumière visible et la réémet sous forme de fluorescence, à partir de trois acides aminés consécutifs situés au centre de la structure en tonneau β de la protéine. La famille des PF de type GFP a des maxima d'émission de fluorescence qui couvrent tout le spectre de la lumière visible, du bleu profond au rouge lointain. À la fin des années 2000, un autre type de PF a été obtenu à partir de phytochromes, une famille de photorécepteurs activés par la lumière rouge utilisant des bilines comme chromophore. L'intérêt de ces PF est que leurs maxima d'excitation et d'émission de fluorescence se situent dans la région du proche infrarouge du spectre lumineux. Cette région fait partie de la "fenêtre optique" des tissus vivants, dans laquelle l'absorption et la diffusion de la lumière par l'hémoglobine, l'eau et les lipides sont minimisées, et est donc la région du spectre à utiliser pour l'imagerie de fluorescence de corps entier. Ces protéines fluorescentes dans le proche infrarouge ont ainsi été appelées NIR-FPs. Au cours ce travail de thèse, j'ai résolu les structures cristallographiques de trois PF de type GFP (une PF verte très brillante, une chromoprotéine et une PF faiblement fluorescente dans le rouge) et de trois NIR-FPs dérivées d'un phytochrome monomérique. Les informations structurelles acquises sur la nature et l'environnement des chromophores m'ont permis d’expliquer leurs propriétés spectroscopiques particulières. Notamment, la structure de la chromoprotéine a révélé pour la première fois l'existence d'un chromophore qui forme une liaison covalente avec un résidu cystéine voisin, qui entraîne un décalage significatif vers le rouge du maximum d'absorption.

Since the cloning of the Green Fluorescent Protein (GFP) in 1992 fluorescent proteins (FPs) have increasingly become essential tools in cell imaging. GFP was first discovered in the jellyfish Aequorea victoria, then homologues were found in other types of organisms such as corals, sea anemones, lancelets and small crustaceans, forming the family of GFP-like FPs. A unique feature of GFP-like proteins is the autocatalytic formation of the chromophore, the light-absorbing and light-emitting part of the protein, from three consecutive amino acids located at the centre of the β-barrel structure of the protein. The family of GFP-like FPs have fluorescence emission maxima that cover the entire visible light spectrum from deep blue to far red. In the late 2000s, another type of FPs has been derived from phytochromes, a family of red-light photoreceptors that use bilins as chromophore. The interest of these is that their fluorescence excitation and emission spectra is in the near-infrared region of the light spectrum. This region is part of the so-called ‘optical window’ of living tissues, in which light absorption and scattering by haemoglobin, water and lipids is minimized and thus should be preferred for whole-body fluorescence imaging . These FPs have been called NIR FPs. In this PhD work, I have solved the crystallographic structures of three GFP-like FPs (one very bright green FP, one chromoprotein and one weakly red fluorescent FP) and three NIR FPs derived from a monomeric phytochrome. The structural information gained on the nature and environment of the chromophores has allowed me to propose explanations for their peculiar spectroscopic properties. In particular the structure of the chromoprotein revealed the existence for the first time of a chromophore which forms a covalent bond with a nearby cysteine residue, leading to a large red-shift of the UV-vis absorption maximum.