Développement de méthodologies électrophoretiques miniaturisées pour l'analyse des anticorps monoclonaux

Development of miniaturized electrophoretic methodologies for the analysis of monoclonal antibodies

• Auteur / Autrice : Meriem Dadouch
• Direction : Catherine Perrin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie Biomoléculaire
• Date : Soutenance le 20/11/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Chimiques (Montpellier ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Biomolécules Max Mousseron (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Antoine Bonnet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Perrin, Pierre-Antoine Bonnet, Ann Van Schepdael, Reine Nehmé, Yoann Ladner, Claire Demesmay-Guilhin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ann Van Schepdael, Reine Nehmé

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse

Électrophorèse capillaire

Qualité -- Contrôle

Anticorps monoclonaux

Mots clés libres

Anticorps monoclonaux

Controle qualité

Électrophorèse capillaire

Microreacteurs enzymatiques

Spectrométrie de masse

Monoclonal antibodies

Quality control

Capillary electrophoresis

Enzymatic microreactors

Mass spectrometry

Résumé

Les anticorps monoclonaux (mAbs) constituent une classe importante des médicaments de biothérapie ciblée. De par leur mode de production, les mAbs présentent diverses micro-hétérogénéités qui peuvent affecter leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Par conséquent, des investigations/contrôles de leurs propriétés physicochimiques et fonctionnelles sont nécessaires pour évaluer leur qualité, efficacité et sécurité. A cette fin, l’électrophorèse capillaire (EC) présente plusieurs avantages dont la miniaturisation et les hautes efficacités de séparation. De plus, l’absence de phase stationnaire en EC permet l’utilisation du capillaire de séparation comme microréacteur enzymatique préalablement à l’étape d’analyse électrophorétique (séparation + détection).Les travaux rapportés dans cette thèse ont porté sur le développement de méthodologies analytiques originales pour le contrôle de mAbs thérapeutiques utilisant l’EC en tant que microréacteur enzymatique et support de séparation, couplée à une détection UV ou spectrométrie de masse par interface sans liquide additionnel (EC-ESI-SM). La méthodologie TDLFP (Transverse Diffusion of Laminar Flow Profile) a été utilisée comme méthode générique pour le mélange par diffusion hydrodynamique de nano-volumes de réactifs et de substrat dans le capillaire. Différentes approches (middle-up et bottom-up) ont été développées. Concernant l’approche middle-up, plusieurs microréacteurs ont été développés : (i) digestion enzymatique des mAbs par l’immunoglobulin-degrading enzyme from Streptococcus pyogenes (IdeS), (ii) réduction des ponts disulfures par le tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) et (iii) digestion enzymatique et réduction simultanées par l’IdeS et par le TCEP. Un microréacteur a également été développé pour l’approche bottom-up. Une étape de prétraitement de l’échantillon de mAb a été réalisée en combinant une étape de dénaturation par le surfactant RapiGest® et une étape de réduction par le dithiothreitol (DTT). La digestion in-line du mAb dénaturé-réduit a été réalisée par une trypsine modifiée résistante à l’autolyse. Les paramètres affectant les mélanges intracapillaires et le rendement des réactions ont été optimisés.Les méthodologies développées ont donné des résultats originaux et présentent plusieurs avantages par rapport aux méthodes de préparation d’échantillon off-line : automatisation, préconcentration, flexibilité par rapport aux conditions d’analyse (dénaturantes et non-dénaturantes), diminution de la consommation des réactifs et du temps d’analyse. Finalement, l’application des méthodologies développées à différents types de mAbs et un conjugué anticorps-médicament (ADC) a démontré leur versatilité et leur spécificité. Parallèlement, des méthodes de séparation ont été développées avec des électrolytes de fond dénaturants et non-dénaturants compatibles à la spectrométrie de masse. Un recouvrement neutre (oxyde de polyéthylène) a été utilisé pour éviter les phénomènes d’adsorption et avoir une résolution de séparation élevée. Les analyses de variants de mAbs intacts ainsi que des produits issus des différentes réactions ont été réalisées avec de grandes efficacités de séparation. Des analyses par EC-ESI-SM, MALDI-SM et nano ESI-SM ont été conduites pour identifier les produits des réactions (middle-up) et mettre en évidence les interactions non-covalentes entre les sous-unités des mAbs dans les conditions non-dénaturantes.

Monoclonal antibodies (mAbs) constitute an important class of targeted biotherapeutics. mAbs exhibit various micro-heterogeneities that can affect the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of mAbs. Consequently, physicochemical and functional investigations/controls are necessary to assess their quality, safety, and efficacy. In this perspective, capillary electrophoresis (CE) has many features among which miniaturization and high separation efficiencies. Additionally, the absence of a stationary phase allows the use of the separation capillary as an enzymatic microreactor before the electrophoretic analysis step (separation + detection). The concept of the microreactor is based on the mixture of nano-volumes of reagents and substrate inside the capillary.This manuscript focuses on the development of original methodologies following different approaches (middle-up and bottom-up) by CE hyphenated to UV or mass spectrometry detector with sheathless interface (CE-ESI-MS). The TDLFP (Transverse Diffusion of Laminar Flow Profile) methodology was used as a generic method for the hydrodynamic diffusion mixing of nano-volumes of reagents and substrate in the capillary. For the middle-up approach, different microreactors were developed: (i) enzymatic digestion of mAbs with the immunoglobulin-degrading enzyme from Streptococcus pyogenes (IdeS), (ii) reduction of disulfide bridges with Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP), and (iii) simultaneous enzymatic digestion and reduction with IdeS and TCEP. A microreactor was also developed for the bottom-up approach. A pretreatment step was performed by combination of a denaturation step with RapiGest® and a reduction step with dithiothreitol (DTT). The in-line digestion of denatured-reduced mAb was performed with modified trypsin resistant to autolysis. The parameters affecting the in-capillary mixing and the yield of reactions were optimized.The developed methodologies provided original results and showed several advantages compared to the off-line assays: automation, preconcentration, flexibility regarding analysis conditions (denaturing or non-denaturing), decrease of reactants consumption and analysis time. The application of the methodologies to different mAbs and anti-drug antibody (ADC) demonstrated their versatility and specificity. In parallel, separation methods were developed with denaturing and non-denaturing background electrolytes compatibles with mass spectrometry. A neutral coating (polyethylene oxide) was used to avoid adsorption and get high resolution of separation. Analyses of intact mAbs variants, as well as the products of different reactions of middle-up analysis were achieved with high separation efficiencies.Finally, analyses by CE-ESI-MS, MALDI-MD, and nano ESI-MS were conducted to identify reactions products/variants (middle-up) and highlight the presence of non-covalent interactions between mAbs subunits under non-denaturing conditions.