Criblage à haut contenu à base d'ARNi et de produits chimiques pour la normalisation du phénotyope XPC

par Farah Kobaisi

Projet de thèse en MBS - Modèles, méthodes et algorithmes en biologie, santé et environnement

Sous la direction de Walid Rachidi et de Hussein Fayyad-Kazan.

Thèses en préparation à l'Université Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale ingénierie pour la santé, la cognition, l'environnement , en partenariat avec Biologie à grande echelle (laboratoire) et de BIOMICS (equipe de recherche) depuis le 07-11-2017 .


  • Résumé

    Xeroderma pigmentosum C (XPC) est une génodermatose génétique rare qui se manifeste cliniquement par une photosensibilité prononcée, une pigmentation anormale, des signes ophtalmologiques et de nombreux cancers de la peau (incidence de mélanome 10 000 fois supérieure). . La XPC est causée par des mutations de gènes impliqués dans la réparation de nucléotide, une voie de réparation de l'ADN impliquée dans l'élimination des adduits volumineux à l'ADN tels que les adduits causés par l'exposition aux rayons ultraviolets. De plus, il a été récemment démontré que le XPC (en plus de son rôle dans la voie NER) peut protéger les cellules contre les dommages oxydatifs de l'ADN, protégeant ainsi les enzymes de réparation de l'excision. Ce rôle supplémentaire pourrait expliquer l'hétérogénéité clinique chez les patients XPC (CSNM et / ou mélanome et / ou diverses tumeurs internes (au niveau de la zone protégée contre les UV). Les cellules de patients XP constituent un outil puissant pour modéliser le cancer de la peau et étudier sa pathogenèse moléculaire (de l'initiation à l'invasion), car l'effet des lésions UV est fortement amplifié dans ces cellules car les lésions ne sont pas réparées. Par conséquent, dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des cellules XPC dérivées du patient et les soumettrons à une bibliothèque de chimères ou à une kinase de ciblage des kinases pour examiner leurs effets sur l'inversion du phénotype photosensible après irradiation par UVB et si de tels traitements permettent de réparer les dommages causés à l'ADN. . La chimiothèque comprend 1280 composés actifs différents et l'autre écran utilisera les banques d'ARNsi ciblant les kinases en raison de leur rôle dans la phosphorylation et la régulation des différents facteurs NER. Les prochaines étapes seront de déchiffrer le mode d'action des hits choisis à l'écran après leur validation dans le filtrage secondaire. Leur effet sur la prolifération, l'apoptose, le cycle cellulaire et la désactivation des ROS sera testé. De plus, les cellules seront également immunisées pour la quantification des dommages à l'ADN et sa réparation au niveau d'une cellule. La cytotoxicité induite par les UV, l'induction de dommages à l'ADN et sa réparation, l'homéostasie redox, les altérations du métabolisme et le profil protéomique permettront de définir une signature biologique de l'hypersensibilité aux UV, ce qui pourrait nous aider à identifier la première étape de la transformation des cellules cutanées. En outre, la surveillance du protéome de XPC et de cellules normales permettra la détection de protéines régulées de manière différenciée et pourrait être à l'origine du taux de développement rapide du cancer dans les cellules XPC par rapport aux cellules normales. De plus, cette surveillance, en particulier dans les outils de modélisation de la maladie à long terme, permettra d'identifier des biomarqueurs pour l'initiation, la progression et l'invasion du cancer de la peau. Il est à noter que les écrans seront réalisés sur des fibroblastes normaux et XPC et que les hits seront utilisés sur des modèles de peau 3D pour tester leurs effets dans des conditions similaires à celles physiologiques. En conclusion, ce projet permettra d'identifier des composés susceptibles d'améliorer le NER dans les cellules XPC, offrant ainsi une passerelle pour le traitement de cette maladie rare.

  • Titre traduit

    RNAi and Chemical-Based High Content Screening for the Normalization of XPC Phenotyope


  • Résumé

    Xeroderma pigmentosum C (XPC) is a rare genetic genodermatosis which manifests clinically as pronounced photosensitivity, abnormal pigmentation, ophthalmological signs and numerous skin cancers (10 000-fold higher incidences of nonmelanoma skin cancer (NMSC) and 2000-fold higher incidence of melanoma). XPC is caused by mutations in genes involved in the Nucleotide Excision Repair (NER), a DNA repair pathway involved in the removal of bulky DNA adducts such as the adducts caused by exposure to UV light. Moreover, it has been recently demonstrated that XPC (in addition to its role in NER pathway) may protect cells from oxidative DNA damage, thereby protecting base excision repair enzymes. This additional role might explain the clinical heterogeneity in XPC patients (NMSC and/or Melanoma and/or various internal tumours (at UV-protected area). Cells from XP patients provide a powerful tool to model skin cancer and to study its molecular pathogenesis (from initiation to invasion) as the effect of UV lesions is greatly amplified in these cells since the damage is not repaired. Therefore, in this project, we will utilize patient-derived XPC cells and subject them to either chemical library or kinase targeting siRNAs library to examine their effects in the reversal of the photosensitive phenotype post UVB irradiation and whether such treatments enable the repair of DNA damage. The chemical library consists of 1280 different active compounds and the other screen will utilize siRNA libraries targeting Kinases as a start due to their role in the phosphorylation and regulation of the different NER factors. The next steps will be deciphering the mode of action of the chosen hits in the screen after their validation in secondary screening. Their effect on proliferation, apoptosis, cell cycle, and quenching of ROS will be tested. Moreover, cells will also be immune-stained for the quantification of DNA damage and its repair at a single-cell level. UVR-induced cytotoxicity, induction of DNA damage and its repair, redox homeostasis, metabolism alterations and proteomic profiling will allow defining a biological signature of hypersensitivity to UVR, which could help us to identify the first step of skin cell transformation. Also, monitoring of proteome of XPC and normal cells will allow the detection of proteins that are differentially regulated and might be the cause for the fast rate of cancer development in XPC cells compared to normal ones. Moreover, this monitoring, especially in long-term disease modelling tools will allow the identification of biomarkers for initiation, progression and invasion of skin cancer. It should be noted that the screens will be carried out on normal and XPC fibroblasts and the hits will be used on 3D skin models to test their effects in conditions similar to the physiological ones. In conclusion, this project will enable the identification of compounds that can improve NER in XPC cells providing a possible gateway for the treatment of such rare illness.