Imagerie des glicerophospholipides pendant la réplication du virus de la Vaccine

Glycerophospholipid fluorescence imaging during Vaccinia Virus replication

• Auteur / Autrice : Andrea Napoli
• Direction : Jacomine Krijnse-Locker
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Virologie
• Date : Soutenance le 15/04/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Virologie moléculaire et Vaccinologie (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Emmanuel Ceccaldi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jacomine Krijnse-Locker, Pierre-Emmanuel Ceccaldi, Britta Brügger, Barbara Müller, Giovanni Maga
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Britta Brügger, Barbara Müller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vaccine

Spectrométrie de masse

Fluorescence

Virus -- Reproduction (biologie)

Poxviridés

Mots clés libres

PIPs (phosphatidylinositoles)

Acide phosphatidique

PI4Ks

PI3Ks

PIPs

Phosphatidic acid

PI4Ks

PI3Ks

Résumé

Le virus de la vaccine (VACV) est l'organisme modèle pour l'étude des Poxviridae. Son cycle de réplication dans le cytoplasme de la cellule hôte a été largement étudié par microscopie optique et microscopie électronique. Grâce à des études génétiques approfondies, le rôle de certaines des 250 protéines du virus a été élucidé. Cependant, les mécanismes d’acquisition de la membrane du virus, notamment le rôle des lipides cellulaires impliqués, restent mal connus. L’étude de la composition des membranes de VACV purifiés par spectrométrie de masse a montré qu’elles présentent un enrichissement en acide phosphatidique (PA) et en dérivés de phosphatidylinositoles (PIPs). De plus, des études in vitro ont permis d’identifier certaines protéines virales capables de se lier aux PIPs in vitro. Le rôle de ces lipides dans le cycle de vie du virus, en particulier, dans la biogenèse de ses membranes n'a pas été identifié. L'objectif de ce projet de thèse est de déterminer l’implication du PA et des PIPs dans la biogenèse des membranes virales. L’expression transitoire de protéines recombinantes contenant des domaines de liaison à ces lipides a permis de déterminer la localisation du PA et des PIPs au cours de la réplication du virus. Afin de compléter ces résultats nous avons également utilisé des anticorps reconnaissant la PI4K et le PI4P. Enfin, l’utilisation d’inhibiteurs des PI3Ks et des PI4Ks a permis d’étudier le rôle de ces kinases durant l’assemblage de la membrane virale. A l'aide de ces outils, j'ai pu montrer que la localisation de ces lipides, à l'exception du PI3P, n'est pas altérée dans les cellules infectées. De plus, aucune co-localisation n’a été observée entre ces lipides et les sites de réplication du virus. Par ailleurs, nous avons observé une co-localisation entre le PI4P et les virus enveloppés ce qui est en accord avec les études précédentes montrant que les membranes du virus mature seraient dérivées de l'appareil de Golgi. Toutefois, des inhibiteurs de la synthèse du PI3P et du PI4P n'ont pas montré d’effets sur la production des membranes virales observables par microscopie optique. En conclusion, ce travail a permis de mieux définir le rôle des lipides durant la réplication de VACV. Ces résultats mettent en lumière un rôle potentiel du PI4P au cours de l’acquisition de l’enveloppe du virus ainsi qu’un rôle PI3P et de protéines reconnaissant spécifiquement le PI3P au cours des phases tardives de la réplication.

Vaccinia Virus (VACV) is the model organism for the study of the Poxviridae. Its cytoplasmic life cycle has been studied extensively by light- and electron microscopy. Thanks to a robust genetic system the role of some of its 250 proteins is beginning to be understood. Nevertheless, the acquisition of its membranes is still a matter of debate, in particular the role of cellular lipids. Lipid mass spectrometry of purified VACV previously showed an enrichment of phosphatidic acid (PA) and phosphatidylinositol derivatives (PIPs) in the viral membrane. Although some viral proteins have been shown to bind PIPs in vitro the role of these lipids in the viral life cycle, in particular viral membrane biogenesis, remains elusive.The aim of this work is to determine whether PA and PIPs are relocated in infected cells to the site of viral membrane biogenesis. For both PA and PIPs, I used recombinant proteins containing PA or PIP binding domains fused to eGFP, expressed them by transient transfection to follow their localization during viral replication. In addition, I used antibodies for the recognition of PI4K and PI4P. In order to understand the biochemical role of PIPs, I used pan-PI3K and PI4K inhibitors to study their effect on viral assembly. Using these tools, I could show that the lipids under investigation did not display an altered localization, with the exception of PI3P which showed a different pattern in infected cells. None of the PIPs analyzed co-localized with the sites of primary VACV membrane biogenesis. Consistent with the fact that the mature virus acquires additional membranes derived from the Golgi complex, I could show a co-localization of wrapped virus with PI4P, known to localize to this cellular organelle. However, drugs inhibiting PI3P and PI4P biosynthesis did not show any effect on VACV membrane biogenesis, at least at the light microscopy level. In conclusion, this work sharper defines the role of lipids during VACV replication. In particular, it opens the way to further studies on the putative role of PI4P during wrapping and the fate of PI3P and PI3P binding proteins during late replication.