Étude de l'hétérogénéité intratumorale génétique et non-génétique du neuroblastome

From intratumor genetic and non-genetic heterogeneity to plasticity in neuroblastoma

• Auteur / Autrice : Simon Durand
• Direction : Isabelle Janoueix-Lerosey
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 27/11/2018
• Etablissement(s) : Paris Sciences et Lettres (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer, Hétérogénéité, Instabilité et Plasticité
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Gilles Vassal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Janoueix lerosey, Hermann Rohrer, Céline Vallot
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Frank Speleman, Julie Caramel

Mots clés

Mots clés libres

Cancer

Neuroblastome

Hétérogénéité

Alk

Mutation

Identité cellulaire

Cancer

Neuroblastoma

Heterogeneity

Alk

Mutation

Cell identity

Résumé

Le neuroblastome est un cancer pédiatrique de l’enfant jeune. Cette tumeur a pour origine le système nerveux périphérique qui est lui-même dérivé des cellules de la crête neurale. Le taux de survie à long terme des patients pour les formes de haut-risque demeure inférieur à 50%, et ce malgré un traitement intensif par chimiothérapie. Le neuroblastome est une tumeur possédant une extrême hétérogénéité clinique et évolutive. Récemment, plusieurs équipes de recherche ont mis en avant l’existence d’hétérogénéité intra-tumorale dans le neuroblastome. Tout d’abord, des mutations du gène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase), un oncogène majeur du neuroblastoma, ont été observées à des niveaux sous-clonaux dans certains cas, et il a été montré que ces mutations sont plus fréquentes à la rechute qu’au diagnostic. Par ailleurs, notre laboratoire, ainsi qu’une autre équipe de recherche, a mis en évidence l’existence d’une hétérogénéité non génétique, celle de l’identité cellulaire dans le neuroblastome, avec des cellules noradrénergiques et des cellules ressemblant aux cellules de la crête neurale. L’implication de l’hétérogénéité génétique et non-génétique dans l’oncogenèse du neuroblastome et son impact sur la potentielle résistance aux traitement actuels restent aujourd’hui peu caractérisés. Dans ce cadre, mon projet, divisé en deux axes, vise d’une part à évaluer l’effet de la présence de sous-clones mutés pour le récepteur ALK dans la progression tumorale et lors de traitements avec des inhibiteurs spécifiques de ALK. D’autre part, mon étude porte sur la caractérisation des deux types d’identités cellulaires observées ainsi que sur leur potentielle plasticité. Tout d’abord, j’ai caractérisé deux lignées de neuroblastome provenant du même patient, l’une établie à partir de la tumeur primaire et l’autre à partir de la moelle envahie. J’ai identifié la présence de deux sous-clones portant une mutation du gène ALK différente (F1174L et L1196M) dans la lignée issue de la tumeur primaire. Ces deux sous-clones ont des propriétés différentes. En étudiant la dynamique de chacun d’eux, j’ai montré que le clone muté ALK F1174L possède un avantage de prolifération in vitro et in vivo alors que le clone muté ALK L1196M est plus résistant aux thérapies ciblées anti-ALK telles que le crizotinib ou l’alectinib. Ces résultats témoignent de l’importance d’étudier l’hétérogénéité tumorale via ce type de modèle. Ils démontrent le besoin de développer des inhibiteurs efficaces contre les différentes versions mutées du récepteur ainsi que l’intérêt de détecter les mutations sous-clonales du gène ALK pour le choix thérapeutique. Dans un second temps j’ai montré au niveau de la cellule unique qu’il existait une hétérogénéité intra-population de l’identité cellulaire dans certains cas. J’ai observé la coexistence de cellules noradrénergiques et de cellules ressemblant aux cellules de la crête neurale au sein de même lignées. De plus, les cellules proches des cellules de la crête neurale expriment des gènes associés à un phénotype mésenchymateux et j’ai montré leur plus grande résistance à la chimiothérapie. J’ai validé le marqueur membranaire CD44 permettant de différencier les deux types cellulaires et montré que les cellules de neuroblastome sont plastiques, capables de passer du type noradrénergique au type mésenchymateux et inversement. J’ai également identifié des inhibiteurs permettant de cibler préférentiellement les cellules de neuroblastome mésenchymateuses résistantes aux chimiothérapies. Ce type de traitement, couplé à une chimiothérapie classique, pourrait constituer une nouvelle approche de traitement du neuroblastome.

Neuroblastoma is the most common extra-cranial solid tumor in children. This tumor develops from the sympathetic nervous system, which is itself derived from the neural crest cells. Long-term survival of high-risk patients is under 50% despite intensive chemotherapy treatment. Neuroblastoma is a very heterogeneous disease in terms of clinical presentation and evolution. Recently, several research teams highlighted the presence of intratumoral heterogeneity in neuroblastoma. In particular, mutations in the major oncogene ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) were identified at subclonal levels in a subset of cases, and it has been shown that these mutations are more frequent at relapse. Moreover, our laboratory, together with another research team, demonstrated the existence of a non-genetic heterogeneity of cell identity in neuroblastoma comprising noradrenergic cells and cells resembling neural crest cells (NCC-like). The involvement of the occurrence of genetic and non-genetic intratumor heterogeneity on the oncogenesis of neuroblastoma and on its putative role in treatment resistance remains obscure. In this context, my project divides into two axes. Firstly, it aims at evaluating the effect of subclonal ALK mutations on tumor progression and during treatment with ALK inhibitors. Secondly, my study focuses on the characterization of the two types of cell identity recently identified and also on their potential plasticity. First, I characterized two neuroblastoma cell lines originating from the same patient. One established from the primary tumor and one from the invaded bone marrow. I observed two different subclones within the cell line from the primary tumor carrying a different ALK mutation (F1174L and L1196M). Both subclones have different properties. By studying their dynamics, I showed that the ALK F1174L subclone is more proliferative both in vitro and in vivo whereas the ALK L1196M subclone is more resistant to ALK inhibitors such as crizotinib and alectinib. These results highlight the need for developing inhibitors efficient on the different ALK mutated forms and the rationale of detecting ALK subclonal mutations for treatment strategies. Then, I showed at the single-cell level that there is an intra-population heterogeneity of cell identity in a number of neuroblastoma cases. I observed the coexistence of noradrenergic and NCC-like identities within the same cell lines. Moreover, the NCC-like cells display features of mesenchymal cells and are resistant to standard chemotherapy treatment. I identified and validated the membrane marker CD44 to differentiate the two different cell types and showed that some neuroblastoma cells are plastic and able to transdifferentiate from one type to the other one. Finally, I identified inhibitors targeting neuroblastoma mesenchymal cells, which would allow new treatment strategies in neuroblastoma coupled with standard chemotherapy.