Réponse de Brucella microti et Brucella suis au stress acide à pH 4.5 : approches transcriptomiques et génétiques

Adaptation of Brucella microti and Brucella suis to acid stress at pH 4.5 : Transcriptomic and genetic approaches

• Auteur / Autrice : Jorge de la Garza García
• Direction : Stephan Köhler, Alessandra Occhialini-Cantet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 22/07/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Anne Blanc-Potard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stephan Köhler, Alessandra Occhialini-Cantet, Anne Blanc-Potard, Xavier de Bolle, Claire Le Marrec, Stéphane Génin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Xavier de Bolle, Claire Le Marrec

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcriptome

Physiologie

Stress oxydatif

Brucella

Bactériologie

Mots clés libres

Bactériologie

Pathogène

Brucella

Adaptative

RNA-Seq

Transcriptomique

Bacteriology

Pathogenic

Brucella

Adaptive

RNA-Seq

Transcriptomique

Résumé

Réponse de Brucella microti et Brucella suis au stress acide à pH 4.5 : approches transcriptomiques et génétiques L´espèce atypique Brucella microti, isolée de la faune sauvage et proche de l´espèce classique et zoonotique Brucella suis bv. 1 1330, diffère de celle-ci de par sa croissance rapide et sa létalité dans la souris. Ce couple de souches est un modèle d’étude pertinent pour la comparaison des espèces classiques et atypiques de Brucella. Malgré le haut degré d’homologie de leurs séquences génomiques (>99 % d´identité), ces espèces sont phénotypiquement différentes et ont développé des réponses spécifiques au stress acide. L’acido-résistance accrue de B. microti pourrait jouer un rôle important dans sa capacité réplicative et sa virulence, en impactant sa survie dans le sol et dans l´hôte. Ce travail a pour objectif l´identification et la caractérisation des facteurs d'acido-résistance des deux espèces par l’analyse transcriptomique comparative in vitro, en milieu minimal à pH 4.5 et pH 7.0, basée sur la technique RNA-Seq. Sur un total de 1376 gènes significativement régulés, l´expression de 106 gènes a été individuellement évaluée par RT-qPCR, aboutissant à un taux de validation de 70 %. Parmi ces gènes d'intérêt, 19 ont été sélectionnés et mutés par délétion ou surexpression chez B. microti et/ou B. suis. 31 souches mutantes ont ensuite été caractérisées pour leurs capacités de survie en milieu acide à pH 4.5 et dans le modèle d'infection cellulaire avec les macrophages murins J774.Cette étude a révélé l'existence d'un groupe central de 651 gènes régulés en réponse au stress acide et communs aux deux espèces. Ce groupe inclut des gènes avec une forte expression lors du stress acide qui codent pour la F1F0-ATPase, des cytochromes (cco et cyd), le complexe I de la chaîne respiratoire, les principales voies métaboliques de l´histidine (opérons his et hut) et le système de l´uréase. B. suis est plus sensible au stress acide et régule spécifiquement un groupe de 284 gènes, avec une expression augmentée de gènes codant pour des protéines de choc thermique et aussi de gènes impliqués dans la biosynthèse des acides nucléiques, du peptidoglycane et du LPS, suggérant l´activation de mécanismes de défense et de réparation essentiels pour préserver l´intégrité structurale bactérienne. En revanche, la réponse spécifique de B. microti est plus prononcée, avec 441 gènes régulés lors du stress acide et avec des particularités différentes, comme la forte expression de gènes liés à la dénitrification, au métabolisme du fer et du souffre et de plusieurs gènes annotés comme pseudogènes chez B. suis, mais potentiellement fonctionnels chez B. microti. L´analyse approfondie d’un groupe de gènes d´intérêt a permis l´identification de deux facteurs qui jouent un rôle important dans l'acido-résistance à pH4.5 chez B. microti : La protéine de "choc froid" CspA, qui est un pseudogène chez B. suis, et Dps (DNA-binding protein from starved cells), une protéine liée au nucléoïde. Par contre, l´inactivation des gènes n´a pas eu d'effets sur la survie intracellulaire des souches mutantes, notamment pendant la période d'acidification de la vacuole précoce contenant Brucella. Les fonctions de CspA et Dps liées à l'acido-résistance confirment notre hypothèse initiale : en dépit d’une très forte similarité génomique, la divergence phénotypique entre les deux espèces est imputable à la présence de mutations ponctuelles et/ou une expression génique différentielle. Cette étude est une première analyse complète et comparative de la régulation transcriptionnelle globale chez une espèce classique et une espèce atypique de Brucella spp. lors de la réponse au stress acide. Les résultats obtenus contribuent à une meilleure compréhension des phénotypes spécifiques de chaque espèce et apportent des évidences solides permettant d'ouvrir la voie vers des recherches complémentaires sur l´adaptation de Brucella spp aux environnements acides.

Adaptation of Brucella microti and Brucella suis to acid stress at pH 4.5: Transcriptomic and genetic approaches The atypical new species Brucella microti, isolated from wild animals and a very close relative of the classical zoonotic species Brucella suis bv. 1 1330, is fast growing and lethal in mice. Both species represent an appropriate model for classical/atypical Brucella spp. comparisons. Despite highly conserved genome sequences with over 99 % identity, these species are phenotypically distinct from one another and developed species-specific responses to acid stress. The more acid-resistant phenotype of B. microti may have major implications in fitness and virulence, influencing bacterial survival in soil and in host.Here, we propose to identify and characterize the acid resistance determinants of both species by an in vitro comparative RNAseq-based transcriptome analysis in minimal medium at pH 4.5 and 7.0. A total of 1376 significantly regulated genes were selected. The expression rate of 106 genes was individually assessed by RT-qPCR, yielding an average validation score of 70 %. 19 acid stress-regulated genes were mutagenized (deleted or overexpressed) in B. microti and/or B. suis and the phenotypes of 31 mutant strains were analyzed for their ability to survive under acid conditions at pH 4.5 and in the murine J774 macrophage infection model.The study revealed a ”core” acid stress response with 651 genes regulated in both species, including higher expression, among others, of genes encoding the F1F0-ATPase components, cytochromes (cco and cyd), the respiratory complex I, the main histidine metabolic pathways (his and hut operons), and the urease system. B. suis, more acid-sensitive, specifically regulated a set of 284 genes, with increased expression of genes coding for diverse heat shock proteins and also nucleic acid-, peptidoglycan-, and LPS synthesis-related genes, indicating the set-up of defense and repair mechanisms essential for structural integrity of the bacteria. In contrast, the species-specific acid stress response of B. microti was more pronounced, regulating 441 genes and displaying different particularities, including the strong activation of genes encoding all steps of the denitrification pathway, participating in iron and sulfur metabolism, and of genes classified as pseudogenes in B. suis, but potentially functional in B. microti.In-depth analysis of genes of interest allowed the identification of two factors directly responsible for the increased long-term acid resistance of B. microti: The cold shock protein CspA (pseudogene in B. suis) and the "DNA-binding protein from starved cells" Dps, a nucleoid-associated protein. In contrast, inactivation of any of the selected genes did not affect intramacrophagic survival of the mutants, notably during acidification of the early Brucella-containing vacuole. The acid resistance-related roles of CspA and Dps confirmed our initial hypothesis, postulating that the marked phenotypical divergence between B. suis and B. microti, existing despite highly conserved genome sequences, was due to point mutations and / or to differential gene expression.This study presents a first thorough, comparative analysis of global transcriptional regulation during acid stress responses of a classical and an atypical Brucella spp. The results obtained contribute to a better understanding of species-specific phenotypes and provide solid evidences that may open new avenues for further investigations on the adaptation of Brucella spp. to acid environments.