Immunothérapie lymphocytaire T γδ contre le cytomégalovirus après transplantation : étude préclinique

par Gabriel MarsÈRes

Projet de thèse en Microbiologie -immunologie

Sous la direction de Lionel Couzi.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux) , en partenariat avec Dechanet-Merville (laboratoire) et de Etude des interactions cellulaires dans la réponse lymphocytaire T (equipe de recherche) depuis le 01-09-2018 .


  • Résumé

    L'infection à Cytomégalovirus (CMV) est la plus fréquente des infections opportunistes après transplantation d'organe solide. Cette infection est associée à une morbidité et une mortalité significative ainsi qu'à plus de perte de greffon. Malgré l'utilisation d'une prophylaxie universelle, la maladie à CMV survient chez 15-20% des receveurs D+R- et 5-10% des receveurs R+. De plus, les traitements antiviraux disponibles actuellement ne sont pas efficaces en cas d'apparition d'une souche virale résistante, et cette situation nécessite le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Compte tenu de de leurs rôles importants in vitro et in vivo dans le contrôle de l'infection à CMV, les cellules T gamma delta ont émergé comme un candidat prometteur de thérapie cellulaire anti-CMV. Jusqu'à présent, de nombreux essais cliniques ont testés les cellules T gamma delta en immunothérapie anti-tumorale. Ici, nous proposons une étude préclinique d'immunothérapie basée sur les cellules T gamma delta pour prévenir et traiter l'infection à CMV après transplantation d'organe solide. Dans cette étude préclinique, nous prévoyons d'utiliser un protocole d'expansion mis au point dans le laboratoire de Bruno Silva Santos (Instituto de Medicina Molecular, Lisbon), dans le but de comparer la capacité d'expansion, le phénotype, la réactivité anti-CMV, et le répertoire des cellules T gamma delta provenant de donneur séropositifs (CMV+) et séronégatif (CMV-) pour le CMV. Nous prévoyons aussi d'identifier de nouveaux ligands reconnus spécifiquement par ces cellules T gamma delta. Le protocole d'expansion est basé sur la stimulation des cellules T gamma delta par un anticorps anti-CD3 combiné à différentes cytokines. Comme observé dans des expériences préliminaires, nous devrions obtenir une large expansion de ces cellules à partir de cellules provenant de donneurs CMV+ et CMV-. Les cellules obtenues devraient avoir un phénotype activé. Leur phénotype de différentiation sera étudié de façon extensive. La réactivité de ces cellules contre des fibroblastes infectés par le CMV sera testé in vitro dans des tests de production d'interféron-gamma. Leurs capacités cytotoxiques seront testées avec un test CD107a. Un panel large de cytokines sera aussi analysé. Finalement, grâce à la production d'anticorps monoclonaux de la même spécificité que celle des TCR des cellules T gamma delta réactives contre le CMV, nous serons capables d'identifier de nouveaux ligands de cellules T gamma delta. L'utilisation de ces ligands permettra de booster de façon spécifique l'expansion des cellules T gamma delta dans le futur. En conclusion, ces résultats nous permettront d'évaluer la faisabilité d'obtenir une expansion significative de cellules T gamma delta réactives contre le CMV. Cette étude est un prérequis indispensable pour déterminer la faisabilité et les limites de cette potentielle immunothérapie cellulaire T gamma delta.

  • Titre traduit

    γδ T cell-based immunotherapy against CMV infection after transplantation: a preclinical study


  • Résumé

    Cytomegalovirus (CMV) infection in solid-organ transplant recipients is the most frequent opportunistic infection and is a major cause of graft loss, morbidity and mortality. Despite universal prophylaxis, CMV disease occurs in 15-20% of D+R- patients and 5-10% of R+ patients. Moreover, available antiviral drugs fail in case of apparition of viral resistance, raising the need for alternative therapies. Given their demonstrated importance against CMV infection in vitro and in vivo, gamma delta T cells represent promising candidates for cellular therapy. Up to now, clinical trials have only focused on their use in cancer immunotherapy. Here, we propose a preclinical study of immunotherapy based on gamma delta T cells to prevent CMV infection in solid organ transplant recipients. In this preclinical study, we plan to use the expansion protocol developed in Bruno Silva Santos's laboratory (Instituto de Medicina Molecular, Lisbon) in order to compare the expansion capacities, the phenotype, the anti-CMV reactivity, and the repertoire of gamma delta T cells from CMV+ and CMV- donors. Besides, we also plan to identify new ligands recognized specifically by these gamma delta T cells. The addition of these ligands could boost gamma delta T cell expansion and improve anti-CMV gamma delta T cell immunotherapy. We will use a protocol of expansion, based on stimulation by an anti-CD3 antibody combined to different cytokines, allowing the enrichment of gamma delta T cells from purified gamma delta T cells coming from CMV seropositive and seronegative donors. As observed in preliminary experiments, we should obtain a large-scale expansion of gamma delta T cells from CMV seropositive and seronegative donors. Expanded cells should display an activated phenotype, and their state of differentiation will be extensively analyzed. The reactivity of expanded gamma delta T cells against CMV-infected fibroblasts in vitro will be measured by IFN-gamma release. Their cytotoxic ability will be tested using the CD107a assay and flow cytometry killing assay. A large panel of cytokines will be also analyzed in the supernatant of these cell cultures using cytokine bead assays. Finally, thanks to the production of monoclonal antibodies of the same specificity as the TCRs of CMV-reactive gamma delta T cells, we should be able to identify the ligands of the gamma delta T cells, which will be critical to boost the expansion of these cells in the future. Taken together these findings should be able to indicate that high fold ex vivo expansion of gamma delta T cells reactive against CMV infected cells is possible, and pave the way for a future immunotherapy against CMV infection in solid-organ transplant recipients. This study is the first prerequisite to determine the feasibility and the limits of a potential gamma delta T cells immunotherapy in both CMV+ and CMV- transplant recipients.