Détection de la résistance à la vancomycine par mise en évidence d'une activité D-Ala-D-Ala dipeptidase

Detection of vancomycin resistance through D-Alanine-D-Alanine dipeptidase activity

• Auteur / Autrice : Windbedema Prisca Ouedraogo
• Direction : Frédéric Fabis, Thomas Cailly
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 02/06/2020
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale normande de chimie (Caen)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'études et de recherche sur le médicament de Normandie (Caen ; 2008-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université de Caen Normandie (1971-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Christophe Giard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Fabis, Thomas Cailly, Pascal Marchand, Vincent Cattoir, Moussa Ouedraogo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pascal Marchand, Vincent Cattoir

Mots clés

Mots clés contrôlés

Diagnostic

Bras réactifs auto-immolables

Enterococcus faecium

Résistance aux antibiotiques

Vancomycine

Mots clés libres

Système auto-immolable

Vancomycin

Antimicrobial resistance

Enterococcus faecium

Self-immolative systems

Résumé

Les antibiotiques de la famille des glycopeptidiques ont été utilisés intensivement chez l'homme et l'animal depuis leur autorisation. L’utilisation massive de la vancomycine en milieu hospitalier, et de l’avoparcine comme facteur de croissance dans l’élevage intensif a induit une pression de sélection et l’émergence d’Enterococcus faecium résistant aux glycopeptides. Selon l'OMS, Enterococcus faecium résistant à la vancomycine représente une menace pour la santé publique mondiale. Des méthodes de détection de la résistance aux glycopeptides existent mais elles sont lentes et/ou coûteuses. La présente étude vise à la découverte d'une méthode rapide de détection de la résistance à la vancomycine qui permettrait une prise en charge précoce et l'isolement du patient, limitant ainsi l’expansion de la résistance. Le concept de la méthode proposée s’appuie sur la détection de la résistance à la vancomycine par mise en évidence de l'activité dipeptidase D-Alanine-D-Alanine de VanX en libérant un chromophore. Pour apporter la preuve de concept de cette méthode, deux esters, le 2-chloronicotinate d’éthyle et le 2-chloronicotinate de tert-butyle ont été fonctionnalisés en position 4 avec une D-alanine N-protégée. Cette fonctionnalisation s’est avérée complexe en raison d’une forte tendance à la cyclisation du système nicotinate, qui prouve d’ailleurs l’efficacité de l’auto-immolation du système que nous proposons. Suivant le même protocole de fonctionnalisation du 2-chloronicotinate de tert-butyle, un premier dérivé furopyridinone avec la séquence D-Ala-D-Ala a été obtenu. Après déprotection, cette molécule peut servir de première molécule-test pour la détection de l’activité VanX. Elle peut également servir de pivot pour la synthèse d’autres molécules pro-chromophores auto-immolables. Un clonage de la protéine VanX a été effectué dans deux types de vecteurs donnant respectivement une protéine recombinante 6xHis-VanX et une protéine recombinante VanX native qui possèdent toutes deux une activité D-Ala-D-Ala dipeptidase.

Glycopeptide antibiotics have been used intensively in humans and animals since they have been approved. Emergence of glycopeptide resistant Enterococcus faecium has been ascribed to a selective pressure due to the increasing use of vancomycine in hospitals and avoparcin as a growth promoter in intensive livestock. Vancomycin resistant Enterococcus faecium represents a serious and increasing threat for world public health according to WHO. Glycopeptides resistance detection methods do exist, however they are slow and/or expensive. The present study aims at discovering a much faster method that would allow early medical care and isolation of the patient, thus limiting the dissemination of the resistance. The concept of the proposed method is based on the detection of vancomycin resistance through the evidencing of a D-Alanine-D-Alanine dipeptidase activity of VanX by releasing a chromophore. To demonstrate the concept of this method, ethyl 2-chloronicotinate and tert-butyl 2-chloronicotinate were functionalized with an N-protected D-alanine. This functionalization has proven to be complex due to a strong tendency towards cyclization of the nicotinate system, which moreover proves the effectiveness of the self-immolation of the system that we offer. Following the same functionalization protocol with tert-butyl 2-chloronicotinate, a first furopyridinone derivative with a D-Ala-D-Ala sequence was obtained. After deprotection, this molecule can be used to detect VanX activity. It can also serve as a pivot for synthesis of self-immolable pro-chromophoric molecules. Cloning and over-expression of the VanX protein was carried out in two types of vectors giving respectively a recombinant protein 6xHis-VanX and a recombinant native protein VanX which both possess D-Ala-D-Ala dipeptidase activity.