Approches analytiques pour l'analyse et la caractérisation d'anticorps thérapeutiques dégradés : intérêt de la spectrométrie de masse en mode non-dénaturant

Analytical approaches for the analysis and characterization of degraded therapeutic antibodies : potentials of native mass spectrometry

• Auteur / Autrice : Minh Thang Le
• Direction : Claire Smadja
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 18/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Galien Paris-Saclay (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 1998-....) - Institut de chimie physique (Orsay, Essonne ; 2000-....) - Istituto di Chimica del Riconoscimento Molecolare (Milan, Italie)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Patrice Prognon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claire Smadja, Patrice Prognon, Yannis François, Davy Guillarme, François Becher, Joëlle Vinh
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Yannis François, Davy Guillarme

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie à force atomique

Réponse immunitaire

Anticorps monoclonaux

Mots clés libres

Anticorps monoclonal thérapeutique

Electrophorèse capillaire

Chromatographie d'exclusion stérique

Spectrométrie de masse

Immunogénicité

Contrôle qualité

Therapeutic monoclonal antibody

Capillary electrophoresis

Size exclusion chromatography

Mass spectrometry

Immunogenicity

Quality control

Résumé

La manipulation des anticorps monoclonaux thérapeutiques (Acm) reconstitués avant administration aux patients est susceptible d’entraîner leurs dégradations physiques (e.g. dénaturation, agrégation). Ceci peut avoir un impact sur leur efficacité et sécurité. Afin d’étudier la conformation et la stabilité des Acms reconstitués, nous avons développé des méthodes séparatives couplées avec la spectrométrie de masse (MS) en conditions non-dénaturantes (« native »). Une méthode de CZE-native MS utilisant un revêtement constitué d’une triple-couche ionique a été développée pour séparer et détecter les différentes conformations (monomère natifs, dénaturés, dimères) d’Infliximab. Une étude approfondie réalisée en analysant de l’infliximab digéré a permis d’établir que la formation du dimère était liée à la dénaturation du fragment Fab. L’intérêt des revêtements statiques (commerciaux et préparés in situ) ont été étudiés pour analyser les Acms par CZE-UV et CZE-MS. Nos résultats ont montré l’intérêt d’un nouveau revêtement monolithique. Un couplage simultané de la SEC avec la MS et un détecteur de fluorescence a été développé. Nous avons ainsi identifié les conditions expérimentales qui entraînaient des dénaturations et des dimérisations artificielles. Cette méthode a ensuite été également appliquée avec succès pour la caractérisation d’un échantillon de Trastuzumab stressé. Une méthode orthogonale en utilisant la SEC-mobilité ionique-MS a été employé pour évaluer la proportion de monomères dénaturés par rapport aux monomères natifs. La méthodologie ainsi développée permettra la détection de très faibles taux d'anticorps dégradés dans des poches d'infusion. Ceci permettra de définir les paramètres critiques à maîtriser lors de la reconstitution et la manipulation d’anticorps à usage hospitalier.

Manufacturing and manipulation of therapeutic monoclonal antibodies (mAb) in the hospital before administration to patient is prone to induce their physical degradations (e.g., denaturation, aggregation). This may impact their efficacy and safety. To study the stability of mAbs, capillary zone electrophoresis (CZE) and size exclusion chromatography (SEC), coupled to native mass spectrometry (MS) have been developed. CZE-native MS method using a triple-layer coating was developed to detect and separate different conformational states (unfolded monomer, dimer) of Infliximab in a single analysis. In-depth study with digested infliximab confirmed that dimer formation was related to the Fab fragment. We also focused on covalent coatings in order to find the more adapted coating to analyze mAbs by CZE-UV and CZE-MS. We also developed for SEC a simultaneous coupling with MS and a fluorescence detector to detect the degraded mAbs. We have identified the biases inducing conformational changes (e.g. dimerization, denaturation) that may arise during native MS. We also successfully characterized aggregates and denatured monomer in stressed Trastuzumab sample. In addition, the orthogonal method SEC-ion mobility-MS has been employed to separate and measure the denatured monomers compared to their related native conformations. Moreover, the developed system enables the detection of a very low levels of degraded mAbs in infusion bags. It allows to define the critical parameters to be controlled during the reconstitution and manipulation of therapeutic mAbs in hospital.