Analyse structurale du complexe de la cohésine

Structural analysis of the cohesin complex

• Auteur / Autrice : Yan Li
• Direction : Daniel Panne
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie physique moléculaire et structurale
• Date : Soutenance le 01/04/2019
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European molecular biology laboratory (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Ramesh Pillai
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Joanna Timmins
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Benjamin Rowland, Camilla Bjorkegren

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génie génétique

Cycle cellulaire

Cohésine

Mots clés libres

Cohesine

Des études structurelles

Cycle cellulaire

Cohesin

Structural studies

Cell cycle

Résumé

Le complexe de la cohésine est requis pour de nombreuses transactions chromosomiques, la cohésion des chromatides soeurs, la réparation des dommages à l'ADN, la régulation de la transcription et le contrôle de l'architecture de la chromatine en 3D. La manière dont la cohésine engage la chromatine est restée une question majeure. Les sous-unités de base de cohesin, Smc1, Smc3, Scc1 assemblent un complexe en forme d’anneau via la connexion des domaines SMC «charnières» hétérodimères fournis par Smc1 et Smc3, et par la liaison des domaines SMC ATPase par Scc1. D'autres facteurs jouent un rôle dans différents aspects de la fonction de la cohésine, tels que Scc3, qui favorise l'association de la cohésine à l'ADN, les complexes de chargement et de déchargement, Scc2-Scc4 et Pds5-Wapl, respectivement responsables du chargement de la cohésine et de sa dissociation de la chromatine. . Au cours de la phase S, une acétyltransférase appelée Eco1 acétyle le domaine ATPase de Smc3 et déclenche l’établissement de la cohésion. Pour augmenter davantage la cohésion, un facteur métazoaire supplémentaire, la sororine forme un complexe avec Pds5 pour empêcher la liaison de Wapl. Pendant la métaphase, la cohésine centromérique est protégée par shugoshin-PP2A. Chez les métazoaires, la cohésine est libérée des chromosomes en deux étapes. La première nécessite la phosphorylation de la cohésine et permet à Wapl de se lier à nouveau à Pds5 afin d'assurer la médiation de la libération de cohésine indépendante du clivage à partir des bras des chromosomes. La seconde se produit lors de la réalisation de l'assemblage de la broche et nécessite l'activation d'une protéase appelée séparase, ce qui entraîne le clivage Scc1, libérant ainsi des chromatides soeurs à séparer dans des cellules filles. Au-delà de la cohésion, il devient également évident que la cohésine joue des rôles plus divers en interagissant avec une multitude d'autres facteurs, notamment la CTCF, une protéine connue comme un isolant, dont il a été rapporté qu'elle collabore à la détermination du génome 3D. structure.Pour comprendre comment la cohesine engage l'ADN, j'ai étudié les propriétés de liaison à l'ADN de sous-complexes précédemment identifiés. En déterminant une structure cristalline de la levure Scc3 liée à un fragment de la sous-unité Scc1 kleisin et de l'ADN, j'ai pu démontrer que Scc3 et Scc1 forment un module d'interaction composite de l'ADN. Le sous-complexe Scc3-Scc1 engage un ADN double brin à travers une surface conservée, chargée positivement. Nous démontrons que ce domaine est requis pour la liaison à l'ADN par Scc3-Scc1 in vitro, ainsi que pour l'enrichissement de la cohésine sur des chromosomes et pour la viabilité cellulaire. Ces résultats suggèrent que l'interface de liaison à l'ADN Scc3-Scc1 joue un rôle central dans le recrutement des complexes de la cohésine sur les chromosomes et donc que cette dernière exécute fidèlement ses fonctions lors de la division cellulaire.Pour étudier les bases moléculaires de la collaboration fonctionnelle signalée entre la cohésine et le CTCF dans la définition de la structure chromosomique 3D, j'ai identifié et déterminé la structure d'un complexe ternaire composé de SA2 humain (un orthologue de Scc3), de Scc1 et de CTCF. La structure révélait un motif de liaison SA2-Scc1 très répandu qui était présent non seulement dans le CTCF, mais aussi dans d’autres facteurs connexes fonctionellement, tels que shugoshin et Wapl. Les tests de compétition déroulants ont indiqué que la liaison de ces facteurs à SA2-Scc1 était mutuellement exclusive, ce qui suggère fortement qu'ils interagissent avec la cohésine via des mécanismes similaires. Pour démontrer ce principe, j'ai pu déterminer une structure de shugoshin en complexe avec SA2-Scc1, ce qui a confirmé que tant le shugoshin que le CTCF se lient à la même surface conservée sur la cohésine.

The cohesin complex is required for numerous chromosomal transactions including sister chromatid cohesion, DNA damage repair, transcriptional regulation and control of 3D chromatin architecture. How cohesin engages chromatin has remained a major question. The basic subunits of cohesin, Smc1, Smc3, Scc1 assemble a ring-shaped complex via connection of the heterodimeric SMC ‘hinge’ domains contributed by of Smc1 and Smc3, and through linkage of the SMC ATPase domains by Scc1. Additional accessory factors play important roles in different aspects of cohesin function, such as Scc3, which promotes the association of cohesin with DNA, the loading and unloading complexes, Scc2-Scc4 and Pds5-Wapl respectively, responsible for cohesin loading and its disassociation from chromatin. During S phase, an acetyltransferase called Eco1 acetylates the ATPase domain of Smc3 and triggers the stabilization, or establishment, of cohesion. To further augment cohesion, an additional metazoan factor, sororin forms a complex with Pds5 to prevent Wapl binding. During metaphase, centromeric cohesin is protected by the shugoshin-PP2A complex. In metazoans, cohesin is released from chromosomes in two major steps. The first requires cohesin phosphorylation and allows Wapl to bind Pds5 again to mediate cleavage-independent release of cohesin from chromosome arms. The second transpires upon fulfilment of spindle assembly and requires activation of a protease called separase, resulting in Scc1 cleavage, thus releasing sister chromatids to be segregated into daughter cells. Beyond cohesion, it is also becoming apparent that cohesin plays more diverse roles by interacting with a plethora of other factors, most notably CTCF, a zinc finger protein that is known as an insulator, which has been reported to collaborate with cohesin in determining 3D genome structure.To understand how cohesin engages DNA, I investigated the DNA binding properties of previously identified globular sub-complexes. By determining a crystal structure of the budding yeast Scc3 bound to a fragment of the Scc1 kleisin subunit and DNA, I could demonstrate that Scc3 and Scc1 form a composite DNA interaction module. The Scc3-Scc1 subcomplex engages double-stranded DNA through a conserved, positively charged surface. We demonstrate that this conserved domain is required for DNA binding by Scc3-Scc1 in vitro, as well as for the enrichment of cohesin on chromosomes and for cell viability. These findings suggest that the Scc3-Scc1 DNA-binding interface plays a central role in the recruitment of cohesin complexes to chromosomes and therefore for cohesin to faithfully execute its functions during cell division.To investigate the molecular basis of the reported functional collaboration between cohesin and CTCF in defining 3D chromosome structure, I identified and determined the structure of a ternary complex composed of human SA2 (an orthologue of Scc3), Scc1 and CTCF. The structure revealed a wide-spread SA2-Scc1 binding motif which was found to be present not only in CTCF, but also other functionally related factors, including shugoshin and Wapl. Competition pulldown assays indicated that binding of these factors to SA2-Scc1 was mutually exclusive, which strongly suggested that they interact with cohesin via similar mechanisms. To demonstrate this principle, I was able to determine a structure of shugoshin in complex with SA2-Scc1, which confirmed that both shugoshin and CTCF bind the same conserved surface on cohesin.