Cryoconservation de cellules spermatiques et de cellules souches pluripotentes de mammifères dans un milieu synthétique et chimiquement défini

Cryopreservation of mammals’ sperm and pluripotent stem cells, in a synthetic and chemically defined medium

• Auteur / Autrice : Lucie Gavin-Plagne
• Direction : Thierry Joly, Samuel Buff, Marielle Afanassieff
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies de la reproduction
• Date : Soutenance le 19/10/2018
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : VetAgro Sup (2010-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-François Guérin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thierry Joly, Pascale Chavatte-Palmer
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Francis Fieni, Catherine Labbé, Anne Pellé

Mots clés

Mots clés contrôlés

Calorimétrie différentielle à balayage

Cellules souches

Sperme

Animaux -- Ressources génétiques

Mots clés libres

Cryobanque

Ressources génétiques animales

Sperme

Cellules souches pluripotentes

Produits d’origine animale

Milieu synthétique

Calorimétrie différentielle à balayage

Mammifères

Cryobanking

Animal genetic resources

Sperm

Pluripotent Stem Cells

Animal-derived Product

Synthetic medium

Differential Scanning Calorimetry

Mammals

Résumé

Cette thèse s’inscrit dans le cadre du projet CRB-Anim (Centre de Ressources Biologiques d’Animaux Domestiques) dont le but est de constituer une cryobanque nationale et d’améliorer les techniques de cryoconservation. Aujourd’hui, les ressources biologiques de type reproductif (embryons, sperme, ovocytes) et de type somatique (fibroblastes et cellules souches pluripotentes) sont conservées dans des milieux contenant des produits d’origine animale (POA). L’utilisation actuelle des POA (sérums, lait, jaune d’œuf) pose des problématiques sanitaires (risque de contamination) et scientifiques (manque de reproductibilité liée à la variabilité de composition des POA). Cette étude a pour objectif d’évaluer l’effet d’un milieu de préservation synthétique, chimiquement défini, breveté pour la congélation de cellules de sang de cordon (STEMALPHA.CRYO3) sur la cryoconservation de sperme ovin et bovin, et de cellules souches pluripotentes de lapin. Pour cela, une approche biologique (étude in vitro et in vivo sur le terrain), alliée à une approche physique (étude des cinétiques de refroidissement et caractérisation des propriétés thermodynamiques des milieux de congélation) ont été mis en place.Nos résultats montrent l’intérêt de l’utilisation du STEMALPHA.CRYO3, en tant que substituant aux sérums, dans les solutions de cryoconservation des cellules souches pluripotentes. Néanmoins, notre étude indique que ce produit n’est pas efficace pour protéger le sperme lors de la congélation. Cette thèse confirme l’intérêt de standardiser les procédures de cryoconservation afin d’assurer la qualité des ressources biologiques pour les cryobanques et les échanges internationaux

Nowadays, reproductive (embryos, sperm, oocytes) and somatic (fibroblasts and pluripotent stem cells) resources are cryopreserved in media containing animal-derived products (serum, egg yolk, milk). Using these products raises sanitary (risk of contamination) as well as scientific concerns (reproducibility limits due to the variability of their composition). This study aims to replace animal derived-product in assessing the effect of a synthetic and chemically defined medium, STEMALPHA.CRY03® (Stem Alpha, France), on the cryopreservation of ovine and bovine sperm, and on rabbit pluripotent stem cells. First, a physical approach permitted to study the cooling rates and the characterization of thermodynamic properties of the freezing media. The differential scanning calorimetry allowed us to define their phase transition temperatures (crystallization temperature, melting temperature and enthalpy variation of crystallization, proportional to the amount of crystallized ice). Second, a biological approach was used for the cryopreservation of bovine and ovine sperm, as well as rabbit pluripotent stem cells. Flow cytometry and computer- assisted sperm analyses showed that STEMALPHA.CRY03® impaired bovine sperm, compared to a medium containing animal derived-product. These last results were confirmed in ovine species. Nevertheless, artificial insemination by laparoscopy (n = 270 ewes) counteracts this impairment and allowed an average pregnancy rate of 70 %. Moreover, without any additive in the freezing medium, a similar pregnancy rate was obtained. The study of pluripotent gene expression profile, and analyses of viability and growth rates for the cryopreservation of rabbit pluripotent stem cells confirmed that synthetic media, STEMALPHA.CRY03® (with 4, 5 or 10 % of cryoprotectant) and CryoStor® CS10 (containing 10 % of cryoprotectant) were more efficient than serum-based media. We demonstrate that it is possible to cryopreserve sperm cells and pluripotent stem cells in synthetic and chemically defined media. 0ur results confirmed the interest of a standardized approach for cryopreservation procedures of genetic resources in mammals. This work meets the needs of cryobanking activities (quality policy) and of the regulation development within the framework of international trade