Synthèse de prodrogues bispécifiques du chondrosarcome, vectorisées vers les protéoglycanes et activables en milieu hypoxique

• Auteur / Autrice : Donia Ghedira-Hellara
• Direction : Jean-Michel Chezal, Farhat Farhat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Organique et Thérapeutique
• Date : Soutenance le 10/12/2018
• Etablissement(s) : Université Clermont Auvergne‎ (2017-2020) en cotutelle avec Université de Monastir (Tunisie)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences fondamentales (Clermont-Ferrand)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Imagerie Moléculaire et Stratégies Théranostiques (IMoST)
• Jury : Président / Présidente : Nicolas Masurier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Valérie Weber, Elisabeth Noirault
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nicolas Masurier, Sylvie Mavel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chondrosarcome

Promédicaments

Mots clés libres

Chondrosarcome

Prodrogues activables en hypoxie

Ammonium quaternaire

Protéoglycanes

Chondrosarcoma

Hypoxia-activated prodrug

Quaternary ammonium

Proteoglycan

Résumé

En raison d’une abondante matrice extracellulaire chondrogénique, peu vascularisée et hypoxique, le chondrosarcome, cancer du cartilage, est une tumeur chimio et radiorésistante. Une stratégie bispécifique s’appuyant sur deux caractéristiques spécifiques du chondrosarcome, une forte densité de charges négatives, ainsi qu’une hypoxie chronique sévère de la matrice extracellulaire, est actuellement développée au laboratoire et consiste à fonctionnaliser une prodrogue activée en hypoxie avec un ammonium quaternaire (AQ). Sur la base de résultats précliniques, une prodrogue, ICF05016, a été identifiée et fait actuellement l’objet d’une étude d’optimisation.Ce projet vise à identifier des relations structure-activité dans une série de moutardes phosphorodiamidates vectorisées par une fonction AQ. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à faire varier la nature des substituants de la fonction ammonium quaternaire ainsi que la longueur du bras espaceur séparant cette dernière de la moutarde. Ainsi, 27 dérivés ont été synthétisés par une séquence commune multi-étapes impliquant la phosphorylation d’un dérivé 2-nitro-5-hydroxyméthylimidazole.Un screening par résonance plasmonique de surface a permis de mettre en évidence 12 composés plus affins envers l’aggrécane que le composé de référence ICF05016. Cette étude a révélé une dépendance importante entre l’affinité à l’aggrécane et la nature de l’ammonium quaternaire, les composés benzyléspossédant tous des affinités supérieures. In vitrosur cultures cellulaires HEMC-SS, les composés ont affichés des ratios de cytotoxicité normoxie vs hypoxie (HCR)supérieurs à celui du lead ICF05016, et notamment le composé benzylé31f.Avec une constante de dissociation à l’aggrécane de 2,10 µM et un différentiel de cytotoxicité normoxie/hypoxie équivalent à celui de l’évosfosfamide en étude clinique, la composé 31f a été évalué en termes de stabilité et de clivage en conditions réductrices, mimant l’hypoxie tumorale. Démontrant une excellente stabilité sur 24 heures dans un tampon phosphate, le composé 31f s’est révélé être réduit par réduction chimique ou enzymatique via une nitroréductase, et ce avec une cinétique rapide. Ce dernier a été ainsi identifié au terme de l’évaluation in vitro et de cet axe de recherche comme un nouveau « lead ».Dans une seconde partie, nous avons choisi de moduler l’halogène et la position des bras alkylants portés par la moutarde phosphorodiamidate. Compte tenu de l’instabilité des composés de la série bromée, par rapport à la série chlorée, les analogues bromés des composés ICF05016 et 31f n’ont pu faire l’objet d’une évaluation in vitro. Pour les isomères de type moutarde ifosfamide, l’instabilité des précurseurs phosphoramidiques et les difficultés de synthèse inhérentes à l’introduction d’une fonction amine secondaire sur un chlorure de phosphoryle préalablement fonctionnalisé, nous ont contraints à réorienter nos travaux vers des structures issues d’une étape de chimie de click, permettant d’introduire le bras vecteur portant la fonction amine tertiaire indépendamment de l’étape de phosphorylation. Cette séquence réactionnelle pourrait être étendue à la synthèse de nouveaux analogues du composé 31f, identifié lors de ces travaux.

Due to an abundant chondrogenic, poorly vascularized and particularly hypoxic extracellular matrix, chondrosarcoma, a malignant cartilaginous tumour, is chemo- and radio-resistant. A dual targeted therapy leveraging specific chondrosarcoma hallmarks, an extensive cartilaginous extracellular matrix, namely the high negative fixed charge density and severe chronic hypoxia,was investigatedby conjugation of a hypoxia-activated prodrug (HAP) to quaternary ammonium (QA) functions. Based on preclinical results, animidazole prodrug, ICF05016, was identified and provided the basis for a lead optimization study.This project was designed to identify structure-activity relationships in a series of QA-targeted phosphorodiamidate mustard conjugates. In a first part, a series of 27 conjugates, with different QA function and length of the alkyl linker, was synthesizedvia a common multi-step sequence involvingphosphorylation of a key 2-nitroimidazole alcohol intermediate. Then, biomolecular interactions between these QA derivatives and aggrecan were assessed using thesurface plasmon resonance technology. This screeningrevealed that the affinity depends more on the natureof the QA function, rather than on the linker length. The most promising results were obtainedwith QA bearing a benzyle group. Twelves compounds were then evaluated in terms of hypoxia selective cytotoxicityonthe HEMC-SS cell line. For all prodrugs, an overall improvement in hypoxic selectivity compared with the ICF05016 was obtained and the positive impact of thebenzyle QA function was again highlighted. With a dissociation constant of 2.10 µM in the SPR experiment and an attractive hypoxic selectivity, compound 31fwas further selected for a stability and reductive activation study. Activation of the prodrug and phosphoramide mustard release under reductive chemical conditions, and nitroreductase-based activation were demonstrated. From this study, compound 31f emerged as the most effective PG-targeted HAPs. In a second part, the nature of the halogen and the position of the alkylating arms carried by the phosphorodiamidic mustard were modified. Given the high instability of the final compounds of the brominated series, compared to the chlorinated series, brominated analogs of the compounds ICF05016 and 31fcould not be obtained with sufficient purity to be evaluated in vitro.For ifosfamide-like isomers, the design of the prodrugs was modified due to the instability of the phosphoramidic precursors or difficulties of introducing a secondary amine function on a phosphoryl chloride previously functionalized.A click chemistry approach was developed to tether the spacer arm carrying the tertiary amine function independently of the phosphorylation step and could be extended to the synthesis of triazoleanalogues of the new lead 31f.