Analyse fonctionnelle chez Hevea brasiliensis des gènes HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5, deux orthologues potentiels de ERF1 d’Arabidopsis

Functional analysis in Hevea brasiliensis of the HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 genes, two potential orthologs Arabidopsis ERF1 gene

• Auteur / Autrice : Retno Lestari
• Direction : Pascal Montoro, Suharsono Tjiptohartono
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : BIDAP - Biologie, Interactions, Diversité Adaptative des Plantes
• Date : Soutenance le 15/08/2016
• Etablissement(s) : Montpellier, SupAgro en cotutelle avec Graduate School of the Bogor Agricultural University, Bogor (Indonésie)
• Ecole(s) doctorale(s) : GAIA (Montpellier ; École Doctorale ; 2015-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Amélioration Génétique et Adaptation des Plantes/UMR AGAP Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Kiagus Dahlan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Kiagus Dahlan, Christiane Marque, Utut Widyastuti
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Chantal Teulières, Sri Nanan B. Widiyanto

Mots clés

Mots clés libres

Ethylène

Facteur de réponse à l’éthylène

Facteur de transcription

Hevea brasiliensis

Jasmonate

Transformation génétique

Ethylene

Ethylene Response Factor

Transcription factor

Hevea brasiliensis

Jasmonate

Genetic transformation

Résumé

Le caoutchouc naturel (CN), a cis-1,4-polyisoprene, est produit principalement par Hevea brasiliensis. Le CN est un matériau très important pour l’industrie du transport et médicale. La demande en CN augmente d’année en année. Le CN est obtenu à partir du latex. Le latex s’écoule des laticifères après saignée de l’écorce des hévéas. L’éthéphon, un libérateur d’éthylène, peut être appliqué sur certains clones d’hévéa pour stimuler la production de latex. La saignée et la stimulation à l’éthéphon sont des stress de récolte conduisant à la production de métabolites secondaires et par conséquence au caoutchouc. La biosynthèse et la signalisation de l’éthylène (ET) et de l’acide jasmonique (JA) jouent un rôle crucial dans la réponse aux stress de récolte. Deux gènes codant des facteurs de réponse à l’éthylène (ethylene response factor, ERF), HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5, ont été prédits être orthologue à ERF1 d’Arabidopsis. ERF1 est considéré comme un facteur clé de la réponse de défense à travers l’intégration des voies de signalisation de l’éthylène et du jasmonate. Les transcrits de HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 s’accumulent dramatiquement en réponse à des traitements combinant la blessure, le méthyl jasmonate, et l’éthylène. Ces facteurs sont ainsi supposés être des régulateurs clés au croisement des voies de signalisation de l’éthylène et du jasmonate dans les laticifères. HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 ont plusieurs caractéristiques des facteurs de transcription révélés respectivement lors des expériences de trans-activation et de localisation subcellulaire : ils peuvent activer des éléments GCC agissant en cis des promoteurs des gènes cibles et ils sont présents au niveau du noyau.Dans cette étude, l’analyse fonctionnelle des gènes HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 a été effectuées par sur-expression de ces gènes sous le contrôle de deux promoteurs, 35S CaMV et HEV2.1 dans des lignées transgéniques d’Hevea obtenues par transformation génétique via Agrobacterium tumefaciens. Cette sur-expression a conduit à augmenter les effets des gènes natifs HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5. Vingt-neuf lignées à activité GFP ont été sélectionnées sur un milieu contenant de la paromomycine. Douze lignées ont permis régénérées des plantes mais seulement dix ont produit un nombre suffisant de plantes pour réaliser les observations de phénotypage avec au total 1622 plantes transgéniques acclimatées en serre. Ces dix lignées transgéniques ont été confirmées par hybridation moléculaire de type Southern. L’observation morphologique des plants jusqu’à un an montre que les deux gènes (HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5) favorisent une meilleure croissance, en termes de hauteur des plants, du diamètre des tiges, et du poids frais et sec des parties aériennes et racinaires, avec une plus forte vigueur et tolérance aux stress abiotiques. Les plants sur-exprimant HbERF-IXc5 ont aussi une meilleure performance que ceux sur-exprimant HbERF-IXc4. Ces résultats montrent aussi un système racinaire plus vigoureux et bien équilibré par rapport à la plante entière. Les analyses de RT-PCR en temps réel révèlent que l’expression des gènes HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 est plus forte dans les lignées transgéniques que la lignée sauvage. L’analyse fine des lignées HbERF-IXc5 montre aussi des modifications anatomiques (activité cambiale, nombre de cellules laticifères, amidon, et largeur du xylème).Ce travail est la première analyse fonctionnelle de facteurs de transcription chez Hevea. Des différences ont été observées entre les lignées HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5. Comme ERF1, HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 doivent diriger la réponse à certains stress. HbERF-IXc5 serait un régulateur de la différentiation des laticifers. Cette étude pourrait être complétée par des analyses dans des lignées éteintes pour ces gènes, une comparaison des transcriptomes et métabolome de lignées sauvages et transgéniques, et l’identification des gènes cibles contrôlés par HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5.

Natural rubber (NR) (cis-1,4-polyisoprene) is the main production from Hevea brasiliensis. NR is a very important industrial material for transportation, consumer, and medical. The demand for NR is increasing from year to year. NR is obtained from latex. The latex flows out from laticifers after tapping the bark. Ethephon, an ethylene releaser, can be applied on certain clones to stimulate the latex production. Tapping and ethephon stimulation are sources of harvesting stresses conducing to the production of secondary metabolites and consequent rubber. Ethylene (ET) and jasmonic acid (JA) biosynthesis and signalling pathways play a crucial role in the response to latex harvesting stress. Two Hevea ethylene response factor genes, HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5, were predicted to be orthologue to ERF1 from Arabidopsis. ERF1 was suggested to be a key component of defence responses through the integration of ethylene and jasmonic acid signalling pathways. Transcripts of HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 were dramatically accumulated by combining wounding, methyl jasmonate, and ethylene treatment. These factors were assumed to be a key regulator at the crosstalk of ethylene and jasmonate signalling pathways in latex cells. HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 have several features of transcription factor revealed by transactivation experiment and subcellular localization, respectively: they can activate the GCC cis-acting element of promoters of target genes and are localized in nucleus, In this study, functional analysis of HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 genes have been carried out by overexpression under control of two promoters, 35S CaMV and HEV2.1 in transgenic Hevea lines obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation. This overexpression led to emphasize the effect of native HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 genes. Twenty-nine GFP-positive lines were established on paromomycin selection medium. Twelve lines regenerated plants but only ten led to produce a sufficient number of plants for further phenotyping with totally 1,622 transgenic plants in greenhouse. These ten ines were confirmed as transgenic by Southern blot hybridization. Observation of morphology until one year showed both genes (HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5) promoted a better growth in terms of plant height, stem diameter, and weight of aerial and root system with higher vigour and better tolerance to some abiotic stresses. Plants overexpressing HbERF-IXc5 have also a better performance than HbERF-IXc4. Data also showed a vigorous root system well balanced with regard to the whole plant. Real-time RT-PCR analyses revealed that expression of HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 genes was higher in transgenic lines compared to wild-type . Analysis in details of HbERF-IXc5 lines also showed some changes in anatomy (cambium activity, number of latex cells, starch, and width of xylem).This work is the first successful functional analysis of transcription factors in Hevea. Some differences have been observed between HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5. As ERF1, HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 should drive the response to some stresses. HbERF-IXc5 might be a regulator of laticifer differentiation. This study could be completed with analysis of silenced transgenic lines, comparison of transcriptome, metabolome of wild-type and transgenic lines, and identification of target genes controlled by HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5.