Développement de biosenseurs fluorescents et d’inhibiteurs pour suivre et cibler CDK5/p25 dans le glioblastome

Development of fluorescent biosensors and inhibitors to probe and target CDK5/p25 in glioblastoma

• Auteur / Autrice : Marion Peyressatre
• Direction : May Catherine Morris
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 21/10/2016
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Biomolécules Max Mousseron [Pôle Chimie Balard] / IBMM
• Jury : Président / Présidente : Norbert Bakalara
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : May Catherine Morris, Isabelle Landrieu
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fabienne Mérola, Stéphane Bach

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteurs à activité tyrosine kinase

Fluorescence

Inhibiteurs des tyrosine kinases

Protéines fluorescentes

Indicateurs biologiques

Glioblastome

Protéines kinases

Mots clés libres

CDK5/p25

Protéine kinase

Biosenseur fluorescent

Glioblastome

Détection

Inhibiteur

CDK5/p25

Kinase protein

Fluorescent biosensor

Glioblastoma

Detection

Inhibitor

Résumé

CDK5 est une protéine kinase exprimée de façon ubiquitaire et activée principalement dans le système nerveux central, ou elle joue un rôle important dans la transmission synaptique, la guidance axonale et la migration cellulaire, la plasticité synaptique et le développement neuronal. CDK5 est associée à la protéine p35 au niveau de la membrane cellulaire, et activée par clivage calpaine-dépendant de cette dernière en p25, ce qui conduit à la relocalisation de CDK5/p25 dans le cytoplasme cellulaire. CDK5/p25 phosphoryle de nombreux substrats dont la protéine Tau, contribuant ainsi à l’apparition de plaques neurofibrillaires responsable des pathologies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson, lorsqu’elle est hyperactivée. Plus récemment, l’expression et l’hyperactivation de CDK5 a été décrite comme impliquée dans le développement de cancers et en particulier de tumeurs cérébrales. Toutefois aucune approche ne permet actuellement de détecter et de mesurer l’activité de CDK5/p25 directement dans des cellules vivantes, au sein des tissus et des tumeurs concernées, dû à un manque d’outils fiables et sensibles pour quantifier les changements dynamiques de son activité kinase. Par ailleurs, peu d’inhibiteurs sont actuellement disponibles pour inhiber CDK5/p25, de manière spécifique, la plupart ciblant la poche de fixation de l’ATP.Le premier objectif de ma thèse a consisté à développer un biosenseur d’activité fluorescent de nature peptidique appelé CDKACT5 qui rapporte l’activité kinase de CDK5/p25 recombinante et dans des extraits cellulaires de manière dynamique et réversible suivant stimulation ou inhibition de cette kinase. Une fois caractérisé et validé in vitro, le biosenseur a été appliqué à la détection d’altérations de CDK5/p25 dans différentes lignées cellulaires de glioblastome dans des essais fluorescents d’activité kinase. Enfin CDKACT5 a été introduit dans des cellules neuronales vivantes afin de suivre les changements dynamiques d’activité de CDK5/p25 par microscopie de fluorescence et vidéo microscopie.Le deuxième objectif de ma thèse a consisté à développer un biosenseur fluorescent conformationnel dans le but d’identifier des inhibiteurs non compétitifs de l’ATP ciblant la boucle d’activation de CDK5. Le biosenseur CDKCONF5 a été exploité pour réaliser un criblage haut débit de trois chimiothèques de petites molécules. Les touches identifiées ont été validées et caractérisées in vitro, pour déterminer leur potentiel inhibiteur dans des tests d’activité kinase et de prolifération cellulaire, ainsi que leur mécanisme d’action. Ces molécules constituent des candidats prometteurs pour une chimiothérapie sélective du glioblastome.

CDK5 is a protein kinase ubiquitously expressed but mainly activated in the central nervous system, where it plays an important role in neuronal functions such as synaptic transmission, axonal guidance and migration, synaptic plasticity and neuronal development. CDK5 is associated with p35 protein at the cell membrane, then activated by calpain-mediated cleavage of p35 into p25, which promotes relocalization of CDK5/p25 into the cytoplasm. CDK5/p25 phosphorylates a wide variety of substrates including Tau, thereby contributing to appearance of neurofibrillary plaques responsable for neurodegenerative pathologies such as comme Alzheimer’s et Parkinson’s, when hyperactivated. More recent studies suggest that CDK5 expression and hyperactivation are involved in glioblastoma during cell invasion and CDK5 expression has been reported to be correlated with the pathological grade of gliomas. However there are currently no tools available to monitor CDK5/p25 activity in its native cellular environment, in tissues or in tumours, due to an overall lack of reliable tools to quantify dynamic changes in its kinase activity in a sensitive and continuous fashion. Furthermore, few inhibitors are currently available to target CDK5/p25 in a specific fashion and most of them are ATP competitive inhibitors.The first goal of my thesis was to develop a fluorescent peptide biosensor named CDKACT5, that specifically reports on recombinant CDK5/p25 and on endogenous CDK5 activity in cell extracts in a dynamic and reversible fashion following stimulation or inhibition of this kinase. Once validated in vitro, this biosensor was applied to detect alterations in CDK5/p25 activity in different glioblastoma cell lines in fluorescent kinase activity assays. Finally CDKACT5 was introduced into cultured neuronal cells to monitor dynamic changes in CDK5/p25 activity by fluorescence imaging and time-lapse microscopy.The second goal of my thesis project consisted in developing a conformational fluorescent biosensor to identify non-ATP competitive inhibitors targeting the activation loop of CDK5. CDKCONF5 was implemented to perform a high throughput screen of three small molecule libraries. The hits identified were validated and characterized to determine their inhibitory potential in kinase activity and proliferation assays, as well as their mechanism of action. These compounds constitute promising for selective chemotherapy in glioblastoma.