Mesure par microscopie confocale du métabolisme mitochondrial et du niveau énergétique cellulaire au cours d’épisodes de carences en substrats et/ou en oxygène

Measure by confocal microscopy of the mitochondrial metabolism and energy level of cells exposed to episodes of deprivation in substrata and/or in oxygen

• Auteur / Autrice : Cécile Cottet‐Rousselle
• Direction : Véronique Frachet, Eric Fontaine
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire et sciences de la santé
• Date : Soutenance le 14/12/2016
• Etablissement(s) : Paris, EPHE
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de l'École pratique des hautes études (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut pour l'avancée des biosciences (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Béatrice Morio
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Véronique Frachet, Eric Fontaine, Béatrice Morio, Michel Rigoulet, Frédéric Bouillaud, Christelle Monteil
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Michel Rigoulet, Frédéric Bouillaud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transfert d'électrons

Mitochondries

Mots clés libres

Analyse d’images

Microscopie confocale

PTP

TMRM NADH

Mitochondries

Oxydation phosphorylante

Image analysis

Confocal microscopy

PTP opening

TMRM NADH

Mitochondria

OXPHOS

Résumé

La mitochondrie est un carrefour d’informations au centre du fonctionnement cellulaire puisque son rôle physiologique consiste à récupérer l’énergie fournie par la dégradation des produits issus de notre alimentation pour produire de l’ATP, par le processus d’oxydation phosphorylante. Cependant, des altérations du fonctionnement de la mitochondrie peuvent être responsables de nombreuses pathologies. Parmi les stress métaboliques pouvant entraîner un dysfonctionnement mitochondrial, l’ischémie-reperfusion est un phénomène présent également dans de nombreuses situations pathologiques. L’objectif de ce travail consiste à développer une approche méthodologique basée sur la microscopie confocale et l’analyse d’images afin de décortiquer les conséquences cellulaires des stress métaboliques induits lors d’épisodes de privation de substrats associée ou non à une privation partielle ou totale d’oxygène. Après avoir mis au point le programme d’analyse d’images basée sur la méthode du « tophat », deux approches ont été développées pour visualiser et quantifier la fonction mitochondriale. La première, qui combine le marquage du TMRM et l’autofluorescence du NADH, a permis de mettre en évidence des différences de réponses au stress d’ischémie-reperfusion au niveau de la chaîne respiratoire ou de l’ouverture du PTP pour les quatre types cellulaires testés : HMEC-1, INS1, RT112 ou hépatocytes primaires. La seconde approche a consisté à tester l’utilisation de biosenseurs permettant de suivre les variations de concentration d’ATP (Ateam) ou d’activation de l’AMPK (AMPKAR). Les conditions expérimentales réalisées dans ce travail n’ont pas permis de valider leur utilisation.

Mitochondria form an information hub at the center of the cellular metabolism because of its physiological role consisting in the porduction of ATP from the degradation of porducts stemming from our food through the OXPHOS process. However, changes in the functionnig of the mitochondria can be responsible for numerous diseases. Among the different foms of metabolic stress leading to mitchondrial dysfunctions, ischemia-reperfusion can be found in numerous pathological situations. This work aims at developing a methodological approach based on confocal microscopy and image analysis to dissect –at cell level- the consequences of metabolic stress induced by episodes of deprivation in substrata associated or not with hypoxia or anoxia. Having developed the program of image analysis based on the « tophat » method, two approaches were designed to vizualize and quantify the mitochondrial function. The first one, combining TMRM labelling with NADH fluorescence made it possible to highlight some differences in the response to the stress caused by ischemia-reperfusion at the level of the respiratory chain or concerning the PTP opening in the four cellular types that were tested : HMEC-1, INS1, RT112 or pirmary heaptocyes. The second approach consisted in testing the use of biosensors designed to follow the variations of ATP concentration (ATeam) or the activation of AMPK (AMPKAR). The experimental conditions established in this work did not allow us to validate their use.