Étude du rôle des phosphorylations de Rad51 en Y54 et en Y315 sur son fonctionnement

Role of RAD51’s phosphorylation on Y54 and Y315 on its function

• Auteur / Autrice : Brendan Alligand
• Direction : Fabrice Fleury, François Vallette
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie, biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2015
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé Nantes-Angers
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (Nantes)
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université Nantes-Angers-Le Mans - COMUE (2009-2015) - Université Bretagne Loire (2016-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rad51 Recombinase

Phosphorylation

ADN -- Réparation

Résumé

La Recombinaison Homologue (RH) permet la réparation des dommages à l’ADN les plus délétères : les Cassures double brin. L’étape centrale de la RH est basée sur l’activité d’échange de brins de RAD51. Ainsi, l’activité de RAD51 est cruciale pour le maintien de l’intégrité génomique. Toutefois, cette protéine possède également un côté sombre. En effet, la surexpression de RAD51 permet aux cellules cancéreuses de résister aux traitements. Ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle pour sensibiliser les cellules cancéreuses au traitement. Une meilleure compréhension du contrôle de l’activité de RAD51 aiderait sûrement à développer des stratégies thérapeutiques. L’activité de RAD51 est régulée par des phosphorylations et plusieurs kinases sont connues pour cibler RAD51. C’est le cas de la kinase c-Abl qui phosphoryle les tyrosines Y54 et Y315 en réponse aux dommages à l’ADN. Mais le rôle de ces phosphorylations est peu connu. C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à l’effet de ces phosphorylations sur RAD51. Dans ce but, nous avons produit des mutants de RAD51 mimant la phosphorylation. Leur activité a été analysée et comparée in vitro. Nous avons démontré que le mutant équivalent à une double phosphorylation est incapable de réaliser l’échange de brins. Un défaut de polymérisation de RAD51 serait à l’origine de cette inhibition. Par la suite, la régulation a été étudiée dans le contexte cellulaire. Les résultats préliminaires montrent un effet de la double phosphorylation sur la localisation cellulaire de RAD51. L’inactivation de RAD51 par cette double phosphorylation pourrait participer à la régulation de la voie de la Recombinaison Homologue et serait une étape clef dans la compréhension de la réponse aux dommages à l’ADN

Homologous Recombination (HR) promotes the repair of the most deleterious DNA damage: the Double Strand Break. The main step of HR is based on RAD51’s DNA strand exchange activity. Thus, the activity of RAD51 is crucial to maintain genome integrity. However, this protein also has a dark side since RAD51 overexpression allows cancer cells to become resistant to anticancer treatment. Therefore RAD51 is a potential target for sensitizing cancer cells to treatment. A better understanding of RAD51’s activity regulation might help to develop therapeutic strategies. RAD51 activity is regulated by phosphorylation and several kinases are known to target RAD51. Indeed, Abl kinase phosphorylates Y54 and Y315 in response to DNA damage but the precise role of these phosphorylations is poorly understood. Therefore we investigated the effect of phosphorylation on RAD51 activity. RAD51 mutants mimicking phosphorylation were produced and purified. Their activity was analysed and compared in vitro. We demonstrated that the double phosphorylated RAD51 mutant was unable to perform homologous strand exchange. A defect in RAD51 polymerization could be the cause of the inhibition of the recombinase activity. The regulation of RAD51 through its phosphorylation was thus analysed in cellular context. Our preliminary results underline the effect of the double phosphorylation on the cellular distribution of RAD51. Phosphorylation-mediated inactivation of RAD51 could be involved in the regulation of the Homologous Recombination pathway and might be an important step in understanding the DNA damage response