Caractérisation des propriétés d’un mutant de la protéine Rrp9p de la snoRNP U3 de levure Saccharomyces cerevisiae et mise en évidence d’un réseau de protéines au sein du complexe de maturation précoce des ARNr

Characterization of properties of a mutant of the protein Rrp9p of the yeast Saccharomyces snoRNP U3 cerevisiae and detection of a network of proteins in the early maturation of complex rRNA

• Auteur / Autrice : Guillaume Clerget
• Direction : Christiane Branlant, Mathieu Rederstorff
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 18/12/2015
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Ingénierie moléculaire et physiopathologie articulaire (Vandœuvre-lès-Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Bruno Charpentier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Denis Lafontaine
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Yves Henry, Nicolas Leulliot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions ARN-protéine

Saccharomyces cerevisiae

ARN ribosomiques

Ribosomes

Mots clés libres

Rrp9p

SnoRNP U3

Pré-ARNr 35S

Processome

Rrp36p

S. cerevisiae

Rrp9p

U3 snoRNP

35S pre-RRNA

Processome

Rrp36p

S. cerevisiae

Résumé

La biogenèse des ribosomes est un processus complexe et dynamique requérant l’intervention d’une multitude de facteurs d’assemblage et de maturation pour permettre la maturation du pré-ARNr et l’assemblage des protéines ribosomiques. Chez les eucaryotes, la biogenèse de la petite sous-unité ribosomique 40S, débute dans le nucléole par la transcription d’un long précurseur contenant 3 des 4 futurs ARNr matures. Le pré-ARNr 18S est modifié par un ensemble de snoRNP à boîtes C/D et H/ACA et libéré par une série de clivages précoces au niveau des sites A0, A1 et A2. Ces clivages se déroulent au sein d’un macro-complexe, le SSU-processome. Celui-ci s’assemble de manière séquentielle à l’extrémité 5’ du pré-ARNr et est composé d’une multitude de facteurs intervenant dans la maturation, notamment de la snoRNP U3, une snoRNP à boîtes C/D qui joue un rôle de chaperon du pré-ARNr. En effet, le snoARN U3 est impliqué dans la formation de 5 appariements avec le pré-ARNr permettant de positionner correctement les sites de clivages A0, A1 et A2. En plus des 4 protéines cœur retrouvées au sein des snoRNP à boîtes C/D, la snoRNP U3 possède une protéine supplémentaire essentielle à la viabilité cellulaire, Rrp9p. En C-terminal, Rrp9 présente un enchainement de 7 domaines WD40 s’organisant en une structure « beta propeller ». Pour définir le rôle essentiel de cette protéine, nous avons généré des mutants et testé leur fonction. Nous avons ainsi pu montrer que le résidu R289 de Rrp9p est important pour les étapes de clivages précoces du pré-ARNr aux sites A1 et A2. De plus, nous avons identifié de nouveaux partenaires de la protéine Rrp9p au sein du processome et montré que le résidu R289 est impliqué dans une interaction directe avec le facteur Rrp36p. Lorsque ce résidu est muté, certains des défauts de croissance cellulaire liés à la stabilisation des appariements établis entre le pré-ARNr et le snoARN U3 par mutation du snoARN U3 sont fortement renforcés, montrant un lien fonctionnel entre Rrp9p et ces appariements. Nous avons mis en évidence un réseau d’interaction au sein du processome impliquant les protéines Rrp9p, Rrp36p, Sgd1p et Rrp5p : Rrp9p interagit avec Rrp36p et Sgd1p, et ces deux dernières interagissent ensemble, ainsi qu’avec Rrp5p. Les domaines responsables de ces interactions ont été étudiés

Ribosome biogenesis is a complex and dynamic process requiring several assembly and maturation factors needed for processing of the pre-rRNA and assembly of the ribosomal protein. In eukarya, biogenesis of the 40S small subunit starts in the nucleolus with the transcription of a long pre-rRNA, containing 3 out of the 4 future rRNAs. The 18S pre-rRNA is modified by several C/D or H/ACA box snoRNPs and processed by endonucleolytic cleavages at sites A0, A1 and A2 sites. These early cleavages occur within a huge complex termed the SSU-processome. The processome assembles at the 5’ extremity of the pre-rRNA, and contains multiple factors, including the U3 snoRNP, a C/D box snoRNP chaperoning the pre-rRNA. Indeed, the U3 snoRNA is involved in formation of 5 intermolecular helix with the pre-rRNA, which defines the A0, A1 and A2 cleavage sites. In addition to the four C/D box snoRNP core proteins, the U3 snoRNP contains additional protein, Rrp9p, required for cell viability. The Rrp9p C-terminal extremity folds into a beta propeller structure. To try to decipher the Rrp9p role, we mutated several surface residues of the beta propeller protein and the effects of the mutations on cell growth were tested. Through this approach, we found that the R289 residue is important for the maturation events at A1 and A2 sites. Moreover, we identified new protein partners of Rrp9p within the processome and showed that R289 residue is involved in a direct interaction with Rrp36p. We identified a network of protein-protein interactions including Rrp9p, Rrp36p, Sgd1p and Rrp5p : Rrp9p interacts with Rrp36p and Sgd1p, Rrp36p and Sgd1p interact together and with Rrp5p. Some of the protein domains involved in the interactions were identified. In addition, the R289A mutation in Rrp9p has a strong negative effect on growth with mutations in U3 snoRNA that destabilize the U3 snoRNA/pre-rRNA interaction