Etude des mécanismes moléculaires de la réponse au stress chez Oenococcus oeni et mise en oeuvre d'outils pour l'exploration fonctionnelle de gènes d'intérêt oenologique

Study of molecular mechanisms of stress response in Oenococcus oeni and implementation of tools for the functional exploration of enological genes

• Auteur / Autrice : Maud Darsonval
• Direction : Cosette Grandvalet, Tarek Msadek
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de l'alimentation
• Date : Soutenance le 09/12/2015
• Etablissement(s) : Dijon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Procédés Alimentaires et Microbiologiques (PAM) (Dijon)
• Jury : Président / Présidente : Pascale Serror
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Dominique Garmyn
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nathalie Leblond-Bourget, Claire Le Marrec

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines de choc thermique

Firmicutes

Biologie moléculaire

Lactobacillales

Mots clés libres

Oeonococcus oeni

Réponse au stress

Régulateur transcriptionnel CtsR

SHsp Lo18

ARN antisens et estérases EstA2 & EstA7

Oeonococcus oeni

Stress response

Transcriptionnal repressor CtsR

SHsp Lo18

Antisense RNA and esterases EstA2 & EstA7

Résumé

O. oeni est responsable de la fermentation malolactique des vins. Elle doit en permanence s’adapter aux fluctuations physico-chimiques de son environnement. La production de protéines Hsp constitue un mécanisme majeur d’adaptation de la bactérie à son environnement. Chez O. oeni, la protéine CtsR est l’unique régulateur identifié à ce jour des gènes hsp. Ce manuscrit aborde la caractérisation des mécanismes de régulation de la réponse au stress chez O. oeni. Une partie de ce travail a consisté à développer un nouvel outil d’expression de gènes chez O. oeni. Cet outil a permis l’étude de la fonction in vivo du gène hsp18 par une technique de modulation de l’expression de gènes par synthèse d’ARN antisens (ARNas). La production d’ARNas ciblant l’ARN messager du gène hsp18 entraîne une diminution du taux protéique de Lo18 et induit une perte de cultivabilité en conditions de stress. Ces résultats montrent, pour la 1ère fois in vivo, l’implication de Lo18 dans la thermotolérance et l’acidotolérance de O. oeni. Cette même approche appliquée au gène ctsR a induit une perte de cultivabilité en conditions de stress confirmant le rôle clef du locus ctsR dans la réponse au stress de O. oeni. Les mécanismes de régulation de l’activité de CtsR ont été appréhendés par complémentation d’un mutant ctsR déficient de B. subtilis via l’expression de ctsR de O. oeni. Des tests de thermoinduction mettent en évidence la thermosensibilité du CtsR de O. oeni dont l’activité est levée à une température inférieure à 33°C. Le pSIPSYN est un outil prometteur valorisé au cours de ce travail par une étude évaluant l’impact de deux estérases de O. oeni, EstA2 et EstA7 sur le profil aromatique du vin.

O. oeni is responsible for wine malolactic fermentation. As any organism, O. oeni tries to adapt its physiology to environmental fluctuations by producing Hsp proteins encoded by the hsp genes. In O. oeni, CtsR is currently the only regulator of hsp genes. As an alternative to the lack of genetic tool, with the goal of understanding the mechanisms of O. oeni stress response, we developed a new expression vector, the pSIPSYN, to produce antisense RNA targeting of hsp18 mRNA. The synthesis of hsp18 asRNA leads to the decrease in the protein level of Lo18 and induced a loss of cultivability after heat or acid shock showing for the first time in vivo involvement of Lo18 in thermotolerance and acidotolerance in O. oeni. The O. oeni ability of the membrane fluidity restoration of after ethanol stress was strongly affected in the presence of asRNAof hsp18 gene. Then, the ctsR function in O. oeni was investigated with this new genetic tool. Inhibition of the ctsR expression by asRNA approach induced a loss of cultivability after heat or acid shock confirming the key role of ctsR locus in the O. oeni stress response. B. subtilis was used to characterize the regulation of CtsR activity. The ctsR gene of O. oeni was expressed to complement a B. subtilis ctsR-deficient strain and restore the wild-type phenotype. Thermoinduction tests performed to understand the thermosensibility of CtsR showed that O. oeni CtsR is a specific thermosensor inactivated at a temperature threshold below 33°C. The pSIPSYN is a promising tool valorized in this work through an oenological study by evaluating of the impact of O. oeni two esterases, and EstA2 EstA7 on wine ester profile.