Régulation de l'intégration du VIH-1 par la protéine TOX4, la transcription et la topologie de l'ADN cellulaire

Regulation of HIV-1 integration by TOX4 protein, transcription and topology of cellular DNA

• Auteur / Autrice : Johan Xavier
• Direction : Marc Lavigne
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la Vie
• Date : Soutenance le 16/07/2014
• Etablissement(s) : Lyon, École normale supérieure
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon)
• Jury : Président / Présidente : Andrea Cimarelli
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marc Lavigne, Andrea Cimarelli, Marie-Line Andréola, Pascale Lesage, Fabienne Hans, Corinne Ronfort
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Line Andréola, Pascale Lesage

Mots clés

Mots clés contrôlés

VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1)

Transcription génétique

Intégrase du VIH

Mots clés libres

VIH-1

Intégrase

LEDGF/p75

TOX4

Transcription

Topologie

HIV-1

Integrase

LEDGF/p75

TOX4

Transcription

Topology

Résumé

L’intégration de la copie ADN du VIH-1 dans le génome d’une cellule infectée est une étape essentielle du cycle réplicatif de ce rétrovirus. Elle est réalisée par une enzyme virale, l’intégrase, qui constitue une cible privilégiée des stratégies antivirales. Différentes études suggèrent une régulation de la sélectivité d’intégration par la chromatine et la transcription. La protéine cellulaire LEDGF/p75, activateur transcriptionnel, interagissant à la fois avec l’intégrase et la chromatine constitue une parfaite illustration de cette régulation.Mon projet de thèse a été d’étudier les liens entre LEDGF/p75, la chromatine et la transcription au cours de l’intégration du VIH-1.Tout d’abord, mes travaux ont permis de valider in vitro l’interaction entre LEDGF/p75 et son partenaire TOX4, récemment identifié par notre équipe. J’ai également montré que le domaine de TOX4, fixant LEDGF/p75, inhibe in vitro l’intégration sur matrice chromatine en présence de LEDGF/p75, suggérant un rôle inhibiteur de TOX4 à l’étape d’intégration du VIH-1.Ensuite, j’ai mis au point des protocoles in vitro de couplage entre l’intégration et la transcription. L’utilisation d’extraits nucléaires pour transcrire par l’ARN polymérase II n’étant pas compatible avec le processus d’intégration, j’ai utilisé l’ARN polymérase T7 purifiée comme machinerie de transcription et étudié les conséquences sur l’intégration. Bien que l’ARN synthétisé inhibe l’intégration, j’ai pu montrer que le passage d’une ARN polymérase sur la matrice d’intégration n’affecte pas l’efficacité globale d’intégration.Enfin, la transcription modifiant la topologie de l’ADN, mon dernier objectif a été d’étudier in vitro l’effet de ce paramètre sur l’intégration. En utilisant des plasmides de différentes formes topologiques comme substrats accepteurs d’intégration, j’ai montré que l’intégration est favorisée sur les formes surenroulées négativement. J’ai également prouvé que cette sélectivité est indépendante de la présence de LEDGF/p75.Mes travaux constituent une étape dans la connaissance des bases moléculaires et mécanistiques de la sélectivité d’intégration du VIH-1 pouvant déboucher sur l’établissement de nouvelles stratégies antirétrovirales.

The integration of the DNA copy of HIV-1 in an infected cell is an essential step of the replication cycle of the retrovirus. It’s performed by a viral enzyme, called integrase, which constitutes a major target of antiviral strategies. Several studies suggest a regulation of integration selectivity by chromatin and transcription. The cellular protein LEDGF/p75, a transcriptional activator, interacting with both integrase and chromatin perfectly illustrates this regulation. My thesis project was to study the links between LEDGF/p75, chromatin and transcription during HIV-1 integration.First, my work validated in vitro the interaction between LEDGF/p75 and its partner TOX4, recently identified by our team. I have also shown that the TOX4 domain, interacting with LEDGF/p75, inhibits integration in vitro on chromatin templates in the presence of LEDGF/p75, suggesting an inhibitory role of TOX4 during the HIV-1 integration step.Then, I developed several in vitro protocols coupling HIV-1 integration and cellular transcription. As RNA polymerase II transcription machinery from Hela nuclear extracts prevents the integration process, I used purified T7 RNA polymerase to perform transcription and studied its consequences on integration. I could show that the synthetized RNA inhibits integration but that the transcription process per se does not affect global integration efficiency on the transcribed template. Since transcription modifies DNA topology, my last goal was to study the effect of this parameter on integration in vitro. Using plasmids of different topological forms as integration acceptor substrates, I showed that integration is enriched in negative supercoiled plasmids. I also proved that this selectivity is independent of the presence of LEDGF/p75. My work constitutes an initial step in understanding the molecular and mechanistic basis of HIV-1 integration selectivity that can lead to the establishment of new antiretroviral strategies.