Mécanisme d'association de deux protéines amyloïdogènes de l'héparane sulfate protéoglycane. Rôle du pH et de l'activité protéasique de la transthyrétine

Association mechanism between two proteins with heparan sulfate proteoglycan. Role of pH and proteolytic activity of transthyretin

• Auteur / Autrice : Ambre Geneste
• Direction : Claire André
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 26/11/2014
• Etablissement(s) : Besançon
• Ecole(s) doctorale(s) : ED 554 - Ecole Doctorale Environnements Santé
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Nanomédecine, imagerie, thérapeutique
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Nanomédecine, imagerie, thérapeutique (Besançon)
• Jury : Président / Présidente : Tijani Gharbi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claire André, Tijani Gharbi, Geneviève Ubeaud-Sequier, Jean-Marc Millot, Bernard Do
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Geneviève Ubeaud-Sequier, Jean-Marc Millot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chromatographie

Nanotubes

Équilibre thermodynamique

Équilibre chimique

Protéoglycanes à héparane sulfate

Transthyrétine

Étiologie

Amylose

Mots clés libres

Amylose

Transthyrétine

Héparane sulfate protéoglycane

Biochromatographie

HPLC

B-amyloïde

Transthyretin

Heparan sulfate protoglycan

Biochromatographie

Biochromatography

HPLC

B-amyloid

Résumé

L’analyse du mécanisme d’interaction de l’héparane sulfate protéoglycane (HSPG) avec lesprotéines amyloïdes et l’effet de paramètres physiologiques (pH,…) sur ce mécanisme nouspermettent une meilleure compréhension des mécanismes menant à l’amyloïdogenèse.La transthyrétine (TTR), molécule circulant à la fois dans le plasma et dans le liquidecéphalo-rachidien, est une des protéines impliquée dans les amyloses. Elle est responsable desamyloses à la TTR et elle joue un rôle dans la maladie d’Alzheimer en séquestrant la protéinebêta-amyloïde (Aβ). La biochromatographie est un outil très efficace pour analyser lemécanisme entre un ligand et son récepteur dans des conditions modulables et se rapprochantdes conditions biologiques. De plus, les nanotubes de carbones (NTCs) peuvent être utiliséspour détecter ou transporter des molécules qui se lient sur leur surface externe et peuventinteragir avec d’autres composés. Au cours de ce travail, un support particulaire a été utilisé où l’HSPG est immobilisé sur desparticules de silice pré-activées par des résidus amines. Ce support remplissant une colonnechromatographique a permis dans un premier temps d’étudier et de comparer les mécanismesd’association entre l’HSPG et une forme sauvage de la TTR et une forme sénile de la TTRextraite d’un patient décédé des suites d’une amylose sénile à la TTR. Cette étude a montréque pour la TTR sauvage, l’association avec l’HSPG est indépendante du pH et implique desinteractions faibles. Pour la TTR sénile, cette association est dépendante du pH. A pH<6,5, laprotonation d’un résidu histidine est observée. De plus, l’étude des paramètresthermodynamiques et de la compensation enthalpie/ entropie montrent un changement dans lemécanisme de fixation avec l’apparition d’interactions ioniques à pH<6,5. Un pH acide estnécessaire pour dissocier et dénaturer partiellement la TTR. L’affinité de la TTR avec l’HSPGdépend de la structure tétramérique quaternaire de la TTR qui présente alors des résiduscapables de créer des interactions. Dans un deuxième temps, cette colonne a permis d’évaluerl’effet de la TTR et du pH sur la liaison Aβ/HSPG. Comme précédemment, la protonationd’un résidu histidine présent sur la Aβ est observée à pH<6,5. Ce résultat confirme des étudesmenées auparavant sur le précurseur de la protéine Aβ. Les résultats thermodynamiques ontmis en évidence que l’affinité de Aβ avec l’HSPG diminuait avec la concentration croissanteen TTR et l’étude des chromatogrammes associés a montré que la TTR ne séquestrait passeulement Aβ mais la clivait en fragments plus courts qui diminuent son affinité avecl’HSPG. Dans la maladie d’Alzheimer, la TTR exerce une activité protéolytique vis-à-vis deAβ.2. Dans un troisième temps, l’effet de la fonctionnalisation de la TTR par des nanotubes decarbone sur la liaison TTR/HSPG a été étudié. Les résultats obtenus montrent que lesinteractions entre l’HSPG et la TTR-NTC sont de type van der Waals et hydrogène. Lesparamètres thermodynamiques des liaisons TTR/HSPG et TTR-NTC/HSPG sont similairespour des pH>6. A pH<6, il n’existe quasiment pas de différences entre les valeurs obtenues àpH >6 et celles obtenues à pH<6. Les NTCs empêcheraient la formation de liaisons ioniques

The analysis of the heparan sulfate proteoglycan (HSPG) association mechanism withamyloid proteins and the effect of physiological parameters (pH,…) on this mechanism allowa better understanding of the mechanisms leading to amyloidogenesis.Transthyretin (TTR), which circulates in both plasma and cerebrospinal fluid, is one of theproteins involved in amyloidosis. It leads to TTR amyloidosis and plays a role in Alzheimer’sdisease in sequestrating the beta-amyloid (Aβ) protein. Biochromatography is an effectivetool for the analysis of the mechanism involved between a ligand and its receptor inadjustable conditions which could be close to biological conditions. Moreover, carbonnanotubes can be used to detect or to carry molecules which bind on its external surface andcould interact with other molecules. In this work, a particulate support was used where the HSPG was immobilized on the silica particles preactivated by amine residues. This support filling a column was used to study andcompare association mechanisms between HSPG and a wild type TTR form and a senile formof the TTR which was was extracted from a patient who died of cardiac failure with a senilesystemic amyloid. This study showed that the association between wild type TTR and HSPGwas independent of the pH and involved weak interactions.For the senile TTR, this association was dependent on pH. At pH<6,5, a histidine residue wasprotonated. Moreover, the study of both thermodynamical parameters and enthalpy-entropycompensation showed a change in the association mechanism with involvement of more ionicinteractions at pH<6,5. An acidic pH was necessary to dissociate and partially denaturate theTTR. The affinity of the TTR with HSPG depends on the tetrameric quaternary structure ofthe TTR which presents some residues which are able to create interactions.In a second time, this column was used to evaluate the effect of both the TTR and the pH onAβ/HSPG binding. As previously, the protonation of a histidine residue present on Aβ wasobserved at pH<6,5. This result confirmed studies on the Aβ precursor. Thermodynamicalvalues highlighted that the affinity of Aβ for l’HSPG decreased with the increase of TTRconcentration, and the study of the chromatograms associated showed that TTR sequestratedAβ and cut Aβ in smaller fragments which decreased its affinity for HSPG. In Alzheimer’sdisease, TTR has a proteolytic activity on Aβ.In a third time, the effect of the carbon nanotubes (CNTs), immobilized on TTR, on theTTR/HSPG binding was studied. Results showed that interactions between TTR-NTC andHSPG are van der Waals and hydrogen. Thermodynamical data of TTR/HSPG et TTRNTC/HSPG bindings are similar at pH>6. At pH<6, no differences between values obtainedat all pH values for TTR-NTC. NTCs would avoid ionic interactions formations.