Homologous recombination protects against mitotic defects and unbalanced chromosome segregation caused by spontaneous replication stress

Recombinaison homologue protège contre les défauts de la mitose et la ségrégation des chromosomes déséquilibre causé par le stress de réplication spontanée

• Auteur / Autrice : Therese Wilhelm
• Direction : Bernard Lopez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 21/01/2011
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Gènes, Génomes, Cellules (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2000-2015)
• Jury : Président / Présidente : Suzanne Sommer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bernard Lopez, Suzanne Sommer, Filippo Rosselli, Jean-Sébastien Hoffmann, Michelle Debatisse
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Filippo Rosselli, Jean-Sébastien Hoffmann

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chromosomes

Centrosomes

Stress oxydatif

Mots clés libres

RECOMBINAISON HOMOLOGUE

STRESS DE REPLICATION

DEFECTS DE CENTROSOME

DEFECTS DE SEGREGATION DE CHROMOSOME

STRESS OXIDATIVE

HOMOLOGOUS RECOMBINATION

REPLICATION STRESS

CENTROSOME DEFECTS

CHROMOSOME SEGREGATION DEFECTS

OXIDATIVE STRESS

Résumé

Les cellules déficientes pour la recombinaison homologue (RH) présentent un ralentissement des fourches de réplication, un nombre aberrant de centrosomes et une aneuploïdie même en absence de stress exogène (Bertrand P 2003, Daboussi F 2005, 2008, Deng 1999, 2002, Griffin 2000, Kraakman-van der Zwet 2002). De plus, la fréquence des mitoses présentant des chromosomes surnuméraires est plus élevée dans ces cellules.L’ensemble des ces résultats suggéraient que le ralentissement des fourches de réplication dans les cellules déficientes pour la RH pourrait avoir un impact direct sur la formation de centrosomes surnuméraires. De plus, nous voulions savoir si cela pouvait également influencer la ségrégation des chromosomes au cours de la mitose. Les résultats que nous avons obtenus sont rassemblés dans l’article intitulé : “Homologous Recombination protects against mitotic defects and unbalanced chromosome segregation caused by spontaneous replication stress”.Le traitement des cellules compétentes pour la RH avec 5µM d’hydroxyurée (HU), un inhibiteur de l’enzyme de synthèse des dNTPs, induit un ralentissement des fourches de réplication parfaitement comparable à celui observé dans les cellules déficientes pour la RH. Après traitement à l’HU des cellules compétentes pour la RH, la fréquence de mitoses présentant des chromosomes surnuméraires augmente et devient similaire à la fréquence de mitoses avec des chromosomes surnuméraires pour les cellules déficientes pour la HR non traitées à l’HU. Nous avons mesuré l’impact de l’HU sur l’apparition des ponts anaphasiques et sur des défauts de ségrégation des chromosomes lors de la mitose. En l’absence de traitement, nous observons une fréquence plus élevée de ponts anaphasiques et de défauts de ségrégation dans des cellules déficientes pour la RH. Des traitements avec 5µM d’HU augmentent la fréquence des ponts anaphasiques et des erreurs de ségrégation dans les cellules compétentes pour la RH, pour atteindre un niveau comparable aux cellules déficientes pour la RH. Ainsi, une altération de la dynamique de réplication consécutive à une déficience de RH ou à un traitment avec de faibles doses d’HU induit des défauts au cours de la mitose. Un lien direct entre une dynamique de réplication anormale et l’apparition d’un nombre aberrant de centrosomes pourrait être la persistance en mitose d’ADN non répliqué ou endommagé.  Comme l’ADN non répliqué ou les fourches bloquées induisent la formation d’ADN simple brin couvert par RPA, nous avons compté le nombre de cellules en G2/M présentant des foyers de RPA, et observé que la fraction de cellules ayant plus de 5 foyers de RPA augmente dans des cellules déficientes pour Brca2. En conclusion, nous proposons un lien direct entre des altérations de la cinétique de réplication, l’apparition de centrosomes surnuméraires et des défauts de ségrégation des chromosomes en mitose dans les cellules déficientes pour la RH même non soumises à un stress exogène. L’utilisation de faibles doses d’HU dans des cellules compétentes pour la RH mime les phénotypes observés dans les cellules déficientes pour la RH et confirme notre modèle.Nous avons également cherché à comprendre les causes du ralentissement des fourches de réplication observé dans les cellules déficientes pour la RH. Il est ainsi possible que les arrêts de fourches spontanés soient une conséquence d’un stress oxydatif endogène. Dans les cellules compétentes pour la RH, le redémarrage des fourches bloquées est possible et assure une progression normale de la réplication de l’ADN. Ceci favorise une ségrégation équilibrée des chromosomes, le maintien de la diploïdie et la stabilité du génome. Dans des cellules déficientes pour la RH, les blocages de fourches devraient être délétères puisque les principaux mécanismes de redémarrage des fourches ne sont pas fonctionnels. De plus, l’arrêt prolongé des fourches ainsi que les cassures double brin générées par l’effondrement des fourches devraient activer des voies de signalisation. Nous avons néanmoins observé que les cellules ne sont pas bloquées dans le cycle cellulaire, ce qui suggère qu’un seuil supérieur de dommages doive être atteint pour induire l’arrêt du cycle. Les stress endogènes ne semblent donc pas suffisamment élevés pour atteindre ce seuil : même si l’ensemble des fourches parcourant le génome sont ralenties, l’activation d’origines cryptiques permet de compenser et ainsi de maintenir la progression dans le cycle. Mais puisque les cellules ne sont pas arrêtées dans le cycle, des fourches bloquées, de l’ADN endommagé ou non répliqué pourraient persister jusqu’à la transition G2/M et in fine perturber le déroulement de la mitose. Des centrosomes multipolaires provoquent la formation de fuseaux multipolaires et favorisent la ségrégation déséquilibrée des chromosomes, entraînant l’aneuploïdie, la déstabilisation du génome et le développement de cancers.

HR deficient cells show slow replication kinetics, aberrant centrosome number and aneuploidy even in the absence of any exogenous stress (Bertrand P 2003, Daboussi F 2005, 2008, Deng 1999, 2002, Griffin 2000, Kraakman-van der Zwet 2002). Frequency of mitosis with extra centrosomes is elevated and replication kinetics decreased in HR deficient compared to HR proficient cells, in the absence of exogenous stress. Thus the question arose, if replication slowing down in HR deficient cells has direct impact on the appearance of supernumerary centrosomes. Furthermore we wanted to know if this might directly impact chromosome segregation. The results we gained are brought together in the paper “Homologous recombination suppression causes spontaneous mitotic alterations through endogenous replication stress”. By treating our HR proficient cells with 5µM HU we found the perfect concentration to mimic replication dynamics of HR deficient cells in an HR proficient background. This concentration was applied to HR proficient cells. After HU treatment the frequency of mitosis with extra centrosomes was elevated in HR proficient cells. Now they showed the same frequency of mitosis with extra centrosomes, than unchallenged HR deficient cells. We measured the impact of HU treatment on occurrence of anaphase bridges or aberrant mitotic segregation. In the absence of treatment higher frequency of anaphase bridges and aberrant mitotic segregation was detected for HR deficient cells. With 5µM HU the frequency of anaphase bridges and aberrant mitosis could be elevated in HR proficient cells. Now they showed aberrant mitotic features with the same frequency than unchallenged HR deficient cells. A direct link between abnormal replication kinetics and aberrant centrosomes might be unreplicated or damaged DNA, that enter mitosis. Unreplicated or blocked DNA might harbour ss DNA bound RPA. Thus we counted G2/M cells with RPA foci. Indeed the fraction of cells that harbour more than 5 RPA foci was elevated in Brca2 deficient in comparison to Brca2 proficient cells. In conclusion we propose a direct link between delayed replication, supernumerary centrosomes and aberrant chromosome segregation in unchallenged HR deficient cells. If we mimicked replication kinetics of HR deficient cells in an HR proficient background, we also mimicked frequency of mitosis with extra centrosome number and aberrant chromosome segregation. Furthermore we investigated the causes of replication slowing down in HR deficient cells. It can be hypothesized that endogenous oxidative stress is implicated in spontaneous fork arrest. In HR proficient cells, reactivation of stalled replication forks and therefore normal replication progression is assured. This favours balanced chromosome segregation, diploidy and genetic stability.In HR deficient cells, replication fork blockage might be detrimental as the main restart mechanism for blocked forks is absent. Prolonged fork blockage or DSB’s arising by fork collapse or resolution of blocked replication forks might activate signalling pathways. However cells are not arrested in cell cycle progression, suggesting that a threshold should be reached to activate cell cycle arrest. Endogenous stress is not sufficient high to reach this threshold. Replication is genome wide slowed down. In this context, the activation of cryptic origins compensates at least partly the slow replication velocity. However, because cells were not arrested in cell cycle progression, some blocked replication forks and damaged or unreplicated DNA regions might persist until G2/M phase and affect centrosome duplication and chromosome segregation. Multipolar centrosomes cause multipolar spindles and favour unbalanced chromosome segregation leading to aneuploidy, genetic instability and cancer development.