Analyse moléculaire des facteurs de réparation de l'ADN et de leur répercussion sur le système immunitaire : étude de Cernunnos, un facteur de NonHomologous End-Joining

Molecular analysis of DNA repair factors and impact of their defect on the immune system : study of Cernunnos, a Nonhomologus End-joining factor

• Auteur / Autrice : Laurent Malivert
• Direction : Jean-Pierre de Villartay
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cassures double-brin de l'ADN

DNA ligases

Système immunitaire

VDJ recombinases

Réparation de l'ADN

Résumé

Le système immunitaire subit de nombreuses cassures double-brin (cdb) de l'ADN, provoquées par des éléments exogènes, ou programmées par la cellule lors de processus physiologiques importants comme la recombinaison V(D)J, qui permet le développement, la diversité et la maturation du système immunitaire. Chez les mammifères, les cdb de l'ADN sont majoritairement réparées par le système de réparation des extrémités non homologues (ou NHEJ), composé de sept facteurs : Ku70 , Ku80 , DNA-PKcs, Artémis, XRCC4, DNA LigaselV et Cernunnos (ou XLF), facteur le plus récemment identifié par notre équipe. Une déficience du NHEJ conduit à une immunodéficience combinée sévère (SCID), à des anomalies du développement, et à des prédispositions au cancer. Ce travail de Thèse revient sur la constitution d'une cohorte de patients SCID grâce à un outil biochimique d'analyse du NHEJ in vitro et sur l'identification de Cernunnos, gène responsable de leur défaut moléculaire. Nous montrons aussi que XRCC4 et Cernunnos partagent des homologies de séquence et de structure, mais ont des fonctions distinctes de réparation de l'ADN. Nous prouvons que Cernunnos appartient au complexe de ligature, constitué de XRCC4 et de DNA LigaselV, et rapportons les dépendances entre ces partenaires. Enfin, en utilisant des mutants de Cernunnos générés in vitro et une série d'essais fonctionnels in vivo, nous démontrons entre autres que la région C-terminale de Cernunnos n'est pas essentielle à sa fonction et définissons la zone d'interaction de Cernunnos avec XRCC4. Toutes ces données établissent que Cernunnos est un élément important de la machinerie du NHEJ, dont la fonction reste cependant encore à préciser.

The immune System is the target of lots of DNA double-strand breaks (dsb), issued from exogenic elements, but also programmed by the cell itself during important physiological processes like the V(D)J Recombination, which allows the development, diversity and maturatiom of the immune System. In mammals, the majority of DNA dsb are processed by the NonHomologous End-Joining pathway (NHEJ), composed of seven factors : Ku70, Ku80 , DNA-PKcs, Artemis, XRCC4, DNA LigaselV and Cernunnos (or XLF), the most recent factor identified by our team. A NHEJ defect leads to a severe combined immunodeficiency (SCID), to which developmental abnormalities and cancer prédisposition can be added. This Thesis work starts with the constitution of a SCID patients's cohort by an improved in vitro NHEJ assay and the identification of Cernunnos, the gene responsible of their defect. We also show that XRCC4 and Cernunnos share homologies of sequence and structure, but have distinct DNA Repair functions. We prove that Cernunnos is part of the ligation complex, constituted by XRCC4 and DNA Ligase IV and we report the interdependance of these partners within the complex. Then, by using in vitro generated Cernunnos mutants (point mutations, protein deletions, and chimeras between XRCC4 and Cernunnos) and different in vivo functional assays, we demonstrate for example that the C-terminal domain of Cernunnos is not required for its function, and define the interaction surface of Cernunnos with XRCC4. All these data establish that Cernunnos is a major component of the NHEJ machinery, even if its function stillneeds to be precised.