Etude physico-chimique des puces à ADN : stabilité du duplex d'ADN, détection des mutations ponctuelles et au-delà

par Julia Fuchs

Thèse de doctorat en Physique pour les sciences du vivant

Sous la direction de Roberto Calemczuk et de Arnaud Buhot.

Soutenue en 2009

à Grenoble 1 .


  • Résumé

    Le travail de cette thèse est axé autour de l'observation de la stabilité du duplexe de l'ADN. Exploitant un système de détection en temps réel basé sur le principe de l'imagerie par la résonance des plasmons de surface, nous utilisons des rampes de température pour mettre en évidence les interactions d'ADN sur une biopuce fonctionnalisée. Un premier travail porte ainsi sur une comparaison de chimies de greffages et l'influence du tampon sur la stabilité du duplex d'ADN. Notamment, la salinité du milieu et l'influence d'un dénaturant de l'ADN sont étudiés. Dans un deuxième temps, la méthode des rampes de température est appliquée à la détection des mutations ponctuelles sur des cibles d'ADN et ARN longues, issus de la polymerase chain reaction (PCR) ou la nucleic acid sequence based amplification (NASBA), respectivement. L'effet de compétition entre cibles mutées et l'hybridation à la surface est abordé. De plus, les structures secondaires en solutions peuvent changer la capture des cibles sur les sondes. La possibilité d'intégrer l'amplification dans un système de détection sur puce est démontrée pour la NASBA. Enfin, en collaboration avec le laboratoire des lésions d'acides nucléiques (LAN) au CEA Grenoble, une étude des interactions et de l'activité de protéines réparatrices sur l'ADN endommagé est présentée, profitant, de nouveau du choix flexible de la température.


  • Résumé

    This Ph. D. Thesis studies phenomena concerning DNA duplex stability. Exploiting a real-time detection system based on Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi), we use a temperature scan method to analyze DNA interactions on functionalized biochips. First, a detailed study about a comparison of two DNA immobilization methods and the influence of different buffer components on surface hybridized DNA duplexes is presented. Especially the influence of salt and denaturing agents in the buffer are discussed. Second, we apply the temperature scan method to point mutation detection, as well for oligonucleotides as for longer DNA or RNA targets produced by Polymerase Chain Reaction (PCR) or Nucleic Acid Sequence Based Amplication (NASBA) amplification protocols, respectively. Competition between targets containing point mutations and surface hybridization is addressed. Also, secondary structures in solution may alter target capture on probes. For the isothermal NASBA amplification, we show that it is possible to make an integrated system with amplification and detection on the SPRi chip. Finally, a study of DNA lesions and repair enzymes is presented in collaboration with the 'Laboratory of Nucleic Acids Lesions' (LAN) at the CEA Grenoble profiting once again from the flexible temperature regulation to characterize enzyme activity on surface grafted DNA.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (196 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 376 réf.

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  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire Joseph-Fourier.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS09/GRE1/0240/D
  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire Joseph-Fourier.
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  • Cote : TS09/GRE1/0240
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