Impact du protocole de transfert par voie rétrovirale du gène de l'enzyme thymidine kinase du virus Herpès Simplex sur le métabolisme protéique et la sensibilité au Ganciclovir de lymphocytes T génétiquement modifiés

The impact of the retroviral-mediated gene transfer protocol of Herpes Simplex Virus thymidine kinase enzyme on protein metabolism and Ganciclovir sensitivity of genetically modified T lymphocytes

• Auteur / Autrice : Emad Bennour
• Direction : Éric Robinet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Besançon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Homme, environnement, santé (Besançon2000-2012)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ganciclovir

Thymidine kinase

Herpès

Transfert génétique

Thérapie génique

Lymphocytes T

Lymphocytes -- Activation

Résumé

L'administration de Ganciclovir permet de contrôler l'alloréactivité de cellules T génétiquement modifiées (CGM) par le transfert ex vivo du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex (HSV-TK). Une limitation à cette approche est liée à la présence d'une forme inactive de ce gène résultant d'un épissage alternatif. Afin de surmonter cette limitation, notre équipe a développé une forme corrigée (cHSV-TK) fusionnée avec la forme tronquée du CD34 (tCD34) permettant un tri immunomagnétique des CGM. Nous montrons dans la première partie de cette thèse que malgré cette correction, des CGM CD34+ mais résistantes au Ganciclovir peuvent être générées après transduction avec un vecteur codant la protéine de fusion tCD34/cHSV-TK par deux mécanismes impliquant des délétions au sein du gène HSV-TK et une protéolyse partielle de la protéine de fusion dont seule la partie CD34 reste exprimée. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons comparé l'ancien protocole de transfert du gène utilisé lors de notre étude clinique de phase I/II, utilisant une activation CD3 et une sélection par G418 à un " nouveau " protocole que nous proposons d'utiliser prochainement, utilisant une costimulation CD3-CD28 et un tri immunomagnétique basé sur le gène de sélection ΔNGFR. Nous montrons que le nouveau protocole présente des avantages en terme de prolifération, de sensibilité à l'apoptose et de métabolisme protéique, dus à la costimulation CD3-CD28 et à l'absence de sélection par G418, mais une expression de molécules HLA de classe II augmentée pourrait possiblement être associée à une immunogénécité accrue des CGM, un élément à considérer lors de l'utilisation de ce nouveau protocole.

The infusion of Ganciclovir can allow controlling the alloreactivity of gene-modified T cells (GMC) expressing the Herpes Simplex virus thymidine kinase (HSV-TK). A limitation to this approach was related to the presence of an inactive form of th HSV-TK gene, resulting from an alternative splicing. In order to circumvent this problem, a corrected HSV-TK (cHSV-TK) gene was fused to a truncated splice variant of the human CD34 molecule (tCD34) allowing for the immunomagnetic sorting of GMC. We demonstrated in the first part of this thesis that, despite this correction, CD34-positive, but Ganciclovir-resistant, GMC can still be generated after transduction with a vector encoding a tCD34/cHSV-TK fusion protein, through two mechanisms involving deletions in the HSV-TK part of the transgene and a partial proteolysis of the fusion protein, of which only the CD34 part is still expressed. In the second part, we compared the " old " protocol previously used to produce GMC during our first clinical trial, using a CD3 activation and G418 selection to a " new " protocol that we propose to use in future studies, using a CD36CD28 activation and ΔNGFR expression-based immunomagnetic selection. We show that the new protocol has advantages in terms of proliferation, sensitivity to apoptosis and protein metabolism, because of the CD3-CD28 costimulation and the absence of G418 selection, but also an increased expression of HLA class II molecules, which could be related to a potentially increased immunogenicity of GMC. This later point should be considered if using the new protocol for future clinical trials.